26. Імунофлюоресценція (прямий та непрямий метод), використання в діагностиці інфекційних хвороб

Імунофлюоресценція (Immunofluorescence) - метод визначення кількості та /або розподілу будь-якого антитіла або антигену в тканинному зрізі. При цьому антитіла маркуються (прямо чи опосередковано) за допомогою флюоресцентного барвника (наприклад, флюоресцина) і потім впливають на тканину, зріз якої вивчається з допомогою ультрафіолетового мікроскопа. У разі прямої імунофлюоресценції (direct immunofluorescence) маркування антитіла проводиться безпосередньо перед його впливом на тканину. При непрямої імунофлюоресценції (indirect immunofluorescence) маркування антитіла проводиться після його з'єднання з антигеном, за допомогою флюоресцентної-маркованої антііммуноглобуліновой сироватки. - Імунофлюоресцентний (immunofluorescent).

27. Механізми живлення бактерій. Класифікація за типами живлення: аутотрофи, гетеротрофи. Сапрофіти та паразити

Залежно від джерела вуглецю:

Аутотрофи(аміноаутотрофи)-джерелом є неорганічні сполуки вуглецю і азоту

Гетеротрофи(аміногетеротрофи)-джерелом є органічні сполуки вуглецю і азоту

Гетеротрофи є

А)сапрофіти-засвоюють органічні речовини відмерлих організмів(гриби,найпростіші,бактерії)

Б)паразити-засвоють органічні речовини живих організмів(гельмінти)

28. Ферменти бактерій та їх класифікація. Поживні середовища, класифікація, вимоги до них. Ростові фактори

Класифікація ферментів: За механізмом дії:оксидоредуктази,трансферази,гідролази,ліази,лігази,ізомерази

За місцем локалізації:ендоферменти(локалізуються в цитоплазмі,ЦПМ або пери плазматичному просторі)

Екзоферменти(виділяються в зовнішнє середовище)

За генетичним контролем:

конститутивні(постійно синтезуються клітиною)

індуктивні(синтезуються за присутності субстрата)

репресивні(їх синтез пригнічується надмірним накопиченням продуктів метаболізму реакції,яка ними каталізується)

За субстратом:протеолітичні,цукролітичні,ліполітичні

Окрема група-ферменти захисту і агресії

Поживні середовища

Вимоги:бактерії потребують азоту,вуглецю,водню.джерелом вуглецю викор. Речовини тваринного походження(м'ясо яловиче,риба,казеїн) а також пептиди,пептони.також входить до пож.сер.ростові фактори(вітами і ферменти),повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза,міді,цинку,марганцю,натрію,калію,мати неорганічні фосфати.Стабілізація рН серед., його високої буферності.Повинні мати в’язкість,густину(рідкі,напіврідкі,щільні),бути ізотонічними,прозорими й обов’язково стерильними.

Класифікація:

1залежно від густини(рідкі,напіврідкі,щільні)

2Природні(згорнута сироватка,молоко,м’язова тканина) і штучні(комбінація різних субстратів)

Є 4 основні групи

1Універсальні(прості)-МПБ,МПА-придатні для культивування багатьох бактерій

2Спеціальні-використ,коли мікроорг.не ростуть на простих середовищах-кровяний,сироватковий агар,сироватковий бульйон,асцитичний агар та бульйон

3Елективні-цілеспрямоване виділення і накопичення бактерій з матеріалу,який містить багато стороніх мікробів.-для холери(1%лужна пептона вода,серед Рута Леффлера –для дифтерії,Плоскирєва-дизентреійна паличка,Мюллер-тифопаратифозних бактерій)

4Диференційно-діагностичнісер.-для визначення певних біохімічних власт мікроорг. І проводити первинну диференціацію

Основні ростові фактори - Вітаміни, пуринів і піримідинів. Найбільш важливі для бактерій водорозчинні вітаміни, які беруть участь у функціонуванні великої кількості ферментів як коензимів. Потреба бактерій в цих продуктах дуже мала (наприклад, зростання стафілококів забезпечує внесення 0003 мг тіаміну і 02 мг нікотинової кислоти на 1 л середовища), то є фактори росту не використовуються в якості пластичного або енергетичного матеріалу, але забезпечують регуляцію метаболізму.

29. Класифікація бактерій за типом дихання. Суть процесів дихання. Методи вирощування анаеробних бактерій.

1Аероби-використовують як кінцевий акцептор кисень:

-облігатні-парціальний тиск кисню 20%

-мікроаерофіли-парціальний тиск кисню 5%(молочнокислі,азот фіксуючі бактерії)

-капнеїчні крім кисню потребують ще 10% СО2(бруцельоз бичачого типу)

2Анаероби-використовують сульфати,карбонати,нітрати,пірувати

-факультативні-можуть використ. Кисень

-облігатні-гинуть в кисневих умовах

Суть процесу дихання бактерій полягає в перебігу біохімічних реакцій, у результаті яких утворюється АТФ, що є універсальним переносником хімічної енергії між взаємно протилежними процесами виділення і споживання енергії.

Таким чином, під терміном «дихання» мають на увазі окисню-вання органічних речовин клітини киснем, унаслідок чого утворюється кінцевий продукт — вуглекислий газ.\

Основні методи створення анаеробних умов для культивування мікроорганізмів.

1.Фізіческій-відкачування повітря, введення спеціальної газової безкисневому суміші (частіше-N 2 - 85%, CO 2 - 10%, H 2 - 5%).

2.Хіміческій-застосовують хімічні поглиначі кисню.

3.Біологіческій-спільне культивування строгих аеробів і анаеробів (аероби поглинають кисень і створюють умови для розмноження анаеробів).

4.Смешанний-використовують декілька різних підходів.

Для культивування анаеробів застосовують особливі методи, сутність яких полягає у видаленні повітря або заміни його спеціалізованої газовою сумішшю (або інертними газами) в герметизованих термостатах - анаеростатах

Іншим способом вирощування анаеробів (найчастіше мікроорганізмів) на поживних середовищах - додавання містять редукують речовини ( глюкозу, муравьинокислого натрій тощо), що зменшують окислювально-відновний потенціал.

GasPak - система хімічним шляхом забезпечує сталість газової суміші, прийнятною для росту більшості анаеробних мікроорганізмів. У герметичному контейнері, в результаті реакції води з таблетками боргідріда натрію і бікарбонату натрію утворюється водень і діоксид вуглецю. Водень потім реагує з киснем газової суміші на палладиевом каталізаторі з утворенням води, вже вдруге вступає в реакцію гідролізу боргідріда

Даний метод був запропонований Брюєром і Олгаером в 1965 році. Розробники представили одноразовий пакет, що генерує водень, який був пізніше вдосконалений ними до саше, що генерують двоокис вуглецю і містять внутрішній каталізатор

Метод Цейсслера застосовується для виділення чистих культур спороутворюючих анаеробів. Для цього роблять посів на середовище Кітт-Тароцці, прогрівають 20 хв при 80 C (для знищення вегетативної форми), заливають середу вазеліновим маслом і інкубують 24 год в термостаті. Потім проводять посів на цукрово-кров'яний агар для отримання чистих культур. Після 24-годинного культивування цікавлять колонії вивчаються - їх пересівати на середу Кітт-Тароцці (з подальшим контролем чистоти виділеної культури).

Метод Фортнера - посіви виробляють на чашку Петрі з потовщеним шаром середовища, розділеним навпіл вузькою канавкою, вирізаної в агарі. Одну половину засівають культуру аеробних бактерій, на іншу - анаеробних. Краї чашки заливають парафіном і інкубують в термостаті. Спочатку спостерігають зростання аеробної мікрофлори, а потім (після поглинання кисню) - зростання аеробної різко припиняється і починається ріст анаеробної.

Метод Вейнберга використовується для отримання чистих культур облігатних анаеробів. Культури, вирощені на середовищі Кітт-Тароцці, переносять в цукровий бульйон. Потім одноразової пастерівською піпеткою матеріал переносять у вузькі пробірки (трубки Віньяля) з цукровим м'ясо-пептонний агар, занурюючи піпетку до дна пробірки. Засіяні пробірки швидко охолоджують, що дозволяє фіксувати бактеріальний матеріал в товщі затверділого агару. Пробірки інкубують в термостаті, а потім вивчають виросли колонії. При виявленні цікавить колонії на її місці роблять розпил, матеріал швидко відбирають і засівають на середовище Кітт-Тароцці (з подальшим контролем чистоти виділеної культури).

Метод Перетца - в розплавлений і охолоджений цукровий агар-агар вносять культуру бактерій і заливають під скло, поміщене на пробкових паличках (або фрагментах сірників) в чашку Петрі. Метод найменш надійний з усіх, але досить простий у застосуванні.

30. Використання біохімічної активності мікроорганізмів в мікробіології та медицині

31. Ріст і способи розмноження бактерій. Механізм клітинного поділу, швидкість і фази розмноження.

Ріст – процес збільшення біомаси клітини внаслідок синтезу нових речовин

Розмноження – процес відтворення подібних собі особин, який забезпечує існування виду

Механізм розмноження:

бінарний поділ

дроблення і спороутворення (у актиноміцетів)

брунькування

Поділ клітин може відбуватись за трьома типами. Випереджаючий - такий тип, при якому утворюються багатоклітинні палички і коки. При синхронному реплікація нуклеоїду супроводжується поділом клітини, й утворюються одноклітинні організми. Третій тип - із випереджаючим поділом нуклеоїду, при якому утворюються багатонуклеоїдні форми бактерій.

Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо.

Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 - мільйони. Через 35 год їх об’єм становитиме до 1000 м 3 , а маса - понад 400 т.

Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від часу культивування, називається кривою росту.

Розрізняють чотири основні фази росту періодичної культури: початкову (або лаг-) , експоненціальну (або логарифмічну ), стаціонарну та відмирання(рис. 3.1) .

Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год.

Експоненціальна (логарифмічна) фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії. Вона залежить від віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи - 30 хв, а грунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час, протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Тривалість фази - 5-8 год.

Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит живильних речовин у середовищі, низький парціальний тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну ( М-) концентрацію, а величину біомаси - терміном вихід або урожай. Ця ознака є специфічною й характерною для кожного виду бактерій. Триває фаза 6-7 год.

Фаза відмирання (до 10 год) супроводжується різким зменшенням числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом власних ферментів.

32. Принципи культивування бактерій. Фактори, які впливають на їх ріст і розмноження

Основні принципи культивування мікроорганізмів на поживних середовищах.(вимоги до пож.сер)

1.Використання всіх необхідних для відповідних мікробів поживних компонентів.

2.Оптімальние температура, рН, rH 2, концентрація іонів, ступінь насичення киснем, газовий склад і тиск.

Мікроорганізми культивують на поживних середовищах при оптимальній температурі в термостатах, що забезпечують умови інкубації.

^ По температурному оптимуму зростання виділяють три основні групи мікроорганізмів.

1.Псіхрофіли-ростуть при температурах нижче +20 градусів Цельсія

2.Мезофіли-ростуть в діапозоні температур від 20 до 45 градусів (часто оптимум-при 37 градусах С).

3.Термофіли-ростуть при температурах вище плюс 45 градусів.

33. Виділення чистих культур аеробних і анаеробних бактерій.

Виділення аеробних бактерій

У перший день дослідження в стерильний посуд (пробірка, колба, флакон) проводять забір патологічного матеріалу. Його вивчають за зовнішнім виглядом, консистенцією, кольором, запахом, готують мазок, фарбують і розглядають під мікроскопом. Посів проводять бактеріологічною петлею, ватно-марлевим тампоном, за допомогою шпателя за методом Дригальського (рис. 26, 27). Чашки закривають, перевертають догори дном, підписують спеціальним олівцем і ставлять у термостат при оптимальній температурі (37° С) на 18-48, а деколи й більше годин. Мета етапу - одержати ізольовані колонії мікроорганізмів

На другий день розглядають чашки і вивчають ізольовані колонії, що виросли на поверхні агару. Звертають увагу на величину, форму, колір, характер країв і поверхні колоній, їх консистенцію та інші ознаки. З підозрілих колоній готують мазки, фарбують за методом Грама для вивчення морфологічних та тинкторіальних властивостей, досліджують рухомість бактерій у “висячій” чи “роздавленій” краплі.Мета- одержання чистої культури

На третій день досліджують характер росту чистої культури мікроорганізмів і проводять її ідентифікацію

Виділення анаеробних мікроорганізмів

обов’язкове дотримання на всіх етапах дослідження анаеробіозу, використовуючи для цього трикомпонентну газову суміш (у певному співвідношенні азот, водень та вуглекислий газ) чи систему “Gas-Pack

На першому етапі (І день дослідження) вивчають макроскопічні особливості клінічного матеріалу, роблять мазок та фарбують його за методом Грама. Після цього його засівають на середовище Кітта-Тароцці та молоко. Середовища ставлять у термостат при температурі 37° С і культивують 1-3 доби (рис. 3.34) .

На другому етапі вивчають прояви росту мікроорганізмів (помутніння, утворення осаду та газу на середовищі Кітта-Тароцці, пептонізація молока). Готують мазок, фарбують за методом Грама і проводять посів матеріалу за методами Вейнберга або Цейсслера для одержання ізольованих колоній.

Третій етап дослідження починається з вивчення морфологічних особливостей колоній, які виросли в чашках Петрі або трубках Віньяль-Вейона. Досліджуються їх форма, величина, колір, характер країв, рельєф колонії, консистенція тощо. З колоній готують мазки, фарбують їх за методом Грама. Після цього колонії відсівають у середовище Кітта-Тароцці для одержання чистої культури. Посіви інкубують певний час при оптимальній температурі.

На четвертому етапі звертають увагу на особливості росту чистої культури збудників на відповідних середовищах, перевіряють її на чистоту і проводять ідентифікацію. Ідентифікують виділені чисті культури анаеробних мікроорганізмів подібно до аеробних за морфологічними, культуральними, біохімічними та біологічними ознаками. Обов’язково використовують визначення токсигенних властивостей збудників у біологічниій пробі та реакції нейтралізації на лабораторних тваринах. У деяких випадках визначають антигенні властивості мікроорганізмів.

34. Розмноження рикетсій. Методи культивування рикетсій.

Рикетсії бінарно діляться(дві форми-вегетативні(діляться) і спочиваючі).Є внутрішньоклітинні паразити.

Культивуються в жовткових мішках курячого ембріона,в легенях білих мишей.Середовище КЖМ(кров-молоко-жовток) для вирощування in vitro.

35. Культивування вірусів. Основні методи. Цитопатична дія вірусів. Індикація вірусів