V_N_Kovalev_Praktikum_po_farmakognozii

Анализ ЛРС, содержащего производные простых фенолов		9 1

фенольных соединений в экстракте

идостоверного образца салицина. Сравните полученные результаты с ти повой хроматограммой (цв. вкл. III, рис. 1).

Методика. Основной раствор 1,0 г порошка сырья (сито 355) помещают в колбу со шлифом вместимостью 50 мл, прибавляют 20 мл метанола

инагревают с обратным холодильником на водяной бане при темпе-

ратуре	50 °C,	часто	перемешивая,
в течение 10 мин. Извлечение охлаж-
дают и фильтруют (раствор А).
К 5,0 мл раствора А добавляют
1,0 мл раствора карбоната натрия
(50 г/л) и нагревают на водяной ба-
не при температуре 60 °C в тече-
ние 10	мин.	Раствор охлаждают
и фильтруют		при	необходимости
(раствор Б).
Раствор сравнения. Растворяют
2,5 мг салицина в 1,0 мл метанола.
Исследуемые растворы и раствор
сравнения наносят по 20 мкл на пла-
стинку полосами длиной 2 см и ши-
риной до 3 мм. Пластинку помеща-
ют в систему этилацетат—метанол—				Рис. 4.9. Ива козья:
вода (77:15:8) и хроматографируют
до продвижения фронта растворите-				а — олиственный побег; б — соцветие мужское;
				в — соцветие женское

лей на 15 cм. Пластинку высушивают

на воздухе, обрабатывают смесью 5 %-ной кислоты серной в метаноле, нагревают в сушильном шкафу при 100—105 °C в течение 5 мин.

Салицин проявляется в средней трети пластинки в виде красновато-фио- летовой зоны. В растворе А зона, соответствующая салицину, проявляется слабо. В растворе Б эта зона проявляется более интенсивно; выше зоны салицина находятся одна или две красновато-коричневые зоны (саликортин или 2′-0-ацетилсаликортин или возможно оба). Другие синие, желтые или коричневые зоны могут проявляться на обеих хроматограммах.

Задание 4. Изучите числовые показатели, характеризующие доброкачествен ность коры ивы.

Числовые показатели по PhEur. Суммы салициловых производных в пересчете на салицин — не менее 1,5 %; влажность — не более 11 %; золы общей — не более 10 %; веток с диаметром больше 10 мм — не более 3 %; других примесей — не более 2 %.

Задание 5. Известно, что кору ивы применяют как противовоспалительное, вяжущее и жаропонижающее средство. Запишите в лабораторном журнале пре параты ивы.

Обратите внимание, что в России листья ивы остролистной Salix acutifolia Willd. используют для получения стандартных флавоноидов — лютеолина и его 7-О-β-D-глюкопираноглюкозида (цинарозида).

9 2		Фенольные соединения. Тема 4. Простые фенолы и их производные

КОРНИ ЭХИНАЦЕИ УЗКОЛИСТНОЙ —

Radices Echinaceae angustifoliae

Задание 1. Ознакомьтесь с внешним видом эхинацеи узколистной по гер барному образцу. Запишите в лабораторный журнал название сырья, лекарствен ного растения и семейства на русском и латинском языках.

Задание 2. Проведите анализ корней эхинацеи узколистной по монографии Британской травяной фармакопеи (Echinaceae angustifoliae radix) в сравнении со стандартным образцом сырья. Запишите, используя схему 12, основные внешние признаки сырья.

Внешние признаки по БТФ. Корни цилиндрические или слегка суживающиеся, иногда спирально скрученные, продольно-морщинистые и глубоко бороздчатые, незаметно переходящие в корневище в верхней части; корневища с остатками стеблей, в диаметре до 15 мм, корни — 4—10 мм; наружная поверхность — от светло-коричневой до желтовато-коричневой.

Задание 3. Ознакомьтесь с числовыми показателями корней эхинацеи узколистной. Объясните, почему качество сырья оценивается по содержанию экстрактивных веществ, извлекаемых водой?

Числовые показатели по БТФ. Экстрактивных веществ, извлекаемых водой,— не менее 15 %; золы общей — не более 9 %; золы, нерастворимой в 10 %-ном растворе кислоты хлористоводородной,— не более 3 %; посторонней примеси не более — 3 %.

Задание 4. Ознакомьтесь с хроматограммой экстрактов корней эхинацеи (цв. вкл. III, рис. 3). Обратите внимание на различия в химическом составе разных видов эхинацеи. Объясните, почему на сырье каждого вида данного рода разра ботана индивидуальная нормативная документация.

ТРАВА ЭХИНАЦЕИ ПУРПУРНОЙ — Herba Echinaceae purpureae

Задание 1. Ознакомьтесь с внешним видом эхинацеи пурпурной по гербар ному образцу и рис. 4.10. Запишите в лабораторный журнал название сырья, лекарственного растения и семейства на русском и латинском языках. Обратите внимание, что кроме травы используются корни данного вида эхинацеи.

Задание 2. Проведите анализ травы эхинацеи пурпурной в сравнении со стандартным образцом сырья (цв. вкл. II, рис. 2). Запишите, используя схему 10, основные внешние признаки сырья. Обратите внимание на характер опушения стеблей и листьев, особенности соцветия.

Анализ ЛРС, содержащего производные простых фенолов				9 3
Внешние признаки. Цельные или изло-
манные олиственные стебли с соцветиями
и бутонами. Стебель длиной до 150 см, тол-
щиной от 0,2 до 0,9 см, слабо разветвлен-
ный, голый, слегка ребристый, голый или
рассеянно грубоволосистый. Листья очеред-
ные, простые, цельные, шероховатые. Ниж-
ние листья с длинными крылатыми череш-
ками, яйцевидные,	резко	суживающиеся
при основании или	слегка	сердцевидные,
с острой верхушкой, зубчатым краем,
пятью продольными жилками, длиной до
16 см и шириной до 9 см. Верхние листья
более мелкие, сидячие, ланцетные или про-
долговато-яйцевидные,		цельнокрайние,

с тремя жилками. Корзинки верхушечные, до 10 см в диаметре, с выпуклым коническим ложем. Обвертка сжато-полушаровид- ная, чешуйчатая, 2—4-рядная; верхушки

ланцетных листочков обычно отогнуты книзу. Рис. 4.10. Эхинацея пурпурная Краевые цветки бесплодные, с длинным 3-зубчатым язычком. Срединные цветки плодущие, трубчатые, с ланцетно-

шиловидными пленчатыми прицветниками. Семянки цилиндрические, до 0,8 см длиной, с перепончатой зубчатой коронкой на верхушке. Запах слабый, приятный. Вкус горьковатый, жгучий. Цвет стеблей — серовато-зеленый, местами антоциановый, листьев — зеленый, листочков обвертки — буровато-зе- леный, прицветников и трубчатых цветков — оранжево-желтый, язычковых цветков — розово-пурпурный разных оттенков, семянок — серовато-бурый.

Задание 3. Ознакомьтесь с числовыми показателями травы эхинацеи пур пурной. Объясните, почему качество сырья оценивается по содержанию полиса харидов и экстрактивных веществ, извлекаемых водой? Почему ограничивается количество стеблей? Как влияет этот показатель на качество сырья?

Числовые показатели. Суммы полисахаридов — не менее 7 %; экстрактивных веществ, извлекаемых водой,— не менее 25 %; влажность — не более 14 %; золы общей — не более 11 %; золы, нерастворимой в 10 %-ном растворе кислоты хлористоводородной,— не более 2 %; стеблей (в том числе отделенных при анализе) — не более 45 %; органической примеси — не более 1,5 %; минеральной примеси не более 2 %.

Задание 4. Эхинацея известна как иммуностимулирующее средство. Запи шите в лабораторном журнале препараты из травы и корней эхинацеи.

КОРНЕВИЩА ЩИТОВНИКА МУЖСКОГО (ПАПОРОТНИКА МУЖСКОГО) — Rhizomata Filicis maris

9 4		Фенольные соединения. Тема 4. Простые фенолы и их производные

Задание 1. Сравните по гербарным образцам, рис. 4.11 и описанию, приве денному в табл. 4.4, щитовник мужской и сходные виды. Запишите в лаборатор ный журнал название сырья, лекарственного растения и семейства на русском и латинском языках.

Т а б л и ц а 4.4

Отличительные признаки щитовника мужского и сходных видов

Задание 2. Проведите анализ корневища мужского папоротника в сравне нии со стандартным образцом сырья. Запишите, используя схему 12, основные внешние признаки исследуемого сырья. Напишите русские и латинские назва ния возможных примесей.

Обратите внимание, что в коммерции сырье известно как европейский аспидиум; полноценным заменителем является корневище Dryopterix marginalis, произрастающий в США и известный как «Американский аспидиум».

Внешние признаки по ст. 298 ГФ Х. Корневище длиной 5—20 см, толщиной 3 см, а вместе с покрывающими его основаниями листовых черешков до 5—7 см; толстые корневища продольно или поперечно разрезаны. Допускаются отдельные основания черешков. На всем протяжении корневище покрыто черепицеобразно расположенными, прижатыми друг к другу основаниями листовых черешков, направленными косо вверх и по направлению к точке, где находятся спирально закрученные листовые почки. Основания листовых черешков покрыты светло-бурыми пленчатыми чешуйками, особенно густо — у точки роста. Цвет корневища и покрывающих его черешков снаружи — черно-бурый, на свежем изломе — светло-зеленый или желто-зе- леный — излом ровный. Корневище на поперечном разрезе неправильно-мно- гоугольное. За темно-бурой линией наружного слоя следует паренхима свет- ло-зеленого цвета. Запах слабый. Вкус сначала сладко-вяжущий, затем слегка раздражающий, неприятный.

Анализ ЛРС, содержащего производные простых фенолов		9 5

Рис. 4.11. Щитовник мужской (а):

б — лист кочедыжника женского и часть сегмента I порядка; в — листья страусника обыкновенного; 1 —корне- вище; 2 — корневище в разрезе; 3 — лист; 4 — часть сегмента с сорусами

Задание 3. Изучите числовые показатели, характеризующие доброкачествен ность корневищ щитовника мужского. Обратите внимание, что срок хранения сы рья — 1 год.

Числовые показатели. Сырого филицина — не болee 1,8 %; влажность — не более 14 %; золы общей — не более 3 %; корневищ, побуревших в изломе и плохо очищенных от корней и остатков отмерших листьев,— не более 5 %; мелких частей, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм,— не более 3 %; посторонних примесей: органической — не более 1 %; минеральной — не более 2 %.

Задание 4. Известно, что корневища мужского папоротника применяют как антигельминтное средство. Запишите в лабораторном журнале препараты папо ротника мужского. Объясните, почему нельзя использовать касторовое масло в качестве слабительного средства совместно с препаратами щитовника.

9 6		Фенольные соединения. Тема 4. Простые фенолы и их производные

?

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1.Дайте определение понятия «Фенольные соединения», приведите их классификацию.

2.Напишите формулы гидрохинона, арбутина, спирта салицилового, кислоты салициловой, салицина, родиолозида, общую формулу фенолкарбоновых кислот.

3.Охарактеризуйте метод выделения арбутина из ЛРС и очистки экстракта от сопутствующих веществ.

4.Охарактеризуйте хроматографический анализ фенольных соединений на примере листьев толокнянки (коры ивы, корней эхинацеи).

5.Перечислите основные этапы количественного определения арбутина в ЛРС.

6.Идентифицируйте по гербарному образцу одно из лекарственных растений: толокнянку обыкновенную, бруснику, чернику, родиолу розовую, виды ивы, виды эхинацеи, фиалку трехцветную, фиалку полевую, щитовник мужской. Напишите латинское название растения и семейства.

7.Идентифицируйте по внешнему виду один из образцов ЛРС: листья толокнянки, листья брусники, корневища и корни родиолы розовой, кору ивы, траву фиалки, корни эхинацеи, траву эхинацеи, корневища щитовника мужского. Напишите латинское название сырья, лекарственного растения и семейства.

8.Назовите места произрастания и основные районы заготовки ЛРС толокнянки обыкновенной, брусники, родиолы розовой, ивы, эхи-

нацеи, фиалки, щитовника мужского. Укажите время заготовки

и правила сбора сырья.

9.Охарактеризуйте особенности сушки листьев толокнянки, листьев брусники, корневищ и корней родиолы розовой, коры ивы, корней эхинацеи, травы фиалки, корневища щитовника мужского. В каких случаях листья толокнянки при сушке темнеют?

10.Укажите, какой класс фенольных соединений встречается в растениях сем. вересковых. Напишите формулу агликона.

11.Как провести качественные реакции на арбутин и дубильные вещества в листьях толокнянки и брусники?

12.Перечислите примеси к листьям толокнянки, листьям брусники, траве фиалки, корневищам щитовника и их основные отличия.

13.Перечислите химический состав листьев толокнянки, листьев брус-

ники, корневищ и корней родиолы розовой, коры ивы, корней

и травы эхинацеи, травы фиалки, корневища щитовника мужского.

14.Охарактеризуйте биологическую активность, препараты и применение листьев толокнянки, листьев брусники, корневищ и корней родиолы розовой, коры ивы, корней и травы эхинацеи, травы фиалки, корневища щитовника мужского.

ТЕМА

5Кумарины

Кумарины — фенольные соединения с общей формулой С6—С3, в основе которых лежит скелет бензо-α-пирона (лактона цис-ортогидрокси- коричной кислоты).

Бензо-α-пирон	Цис-ортогидроксикоричная кислота
(кумарин)

Рис. 5.1. Схема классификации кумаринов

Физико-химические свойства. Кумарины в растениях присутствуют в форме агликонов, реже — гликозидов. Углеводная часть чаще всего представлена глюкозой, присоединенной у С-6, С-7 или С-8 кумаринового ядра. Агликоны растворимы в органических растворителях: хлороформе, диэтиловом эфире, этаноле, жирах и жирных маслах. В воде кумарины в большинстве случаев нерастворимы. Гликозиды растворяются в водно-спиртовых растворах и нерастворимы в неполярных растворителях. Выделенные в индивидуальном состоянии, они представляют собой кристаллические вещества, бесцветные или слегка желтоватые. При нагревании до 100 °С некоторые кумарины возгоняются и оседают на холодных стенках пробирки в виде игольчатых кристаллов.

9 8		Фенольные соединения. Тема 5. Кумарины

Лактонный цикл кумаринов стойкий, при длительном нагревании растворов в воде он не расщепляется. С кислотами и раствором аммиака кумарины не взаимодействуют. Особенностью кумаринов как лактонов является их специфическое отношение к щелочам, под воздействием которых они образуют желтый раствор солей кумариновой кислоты (кумаринаты). При подкислении щелочных растворов цис-ортогидроксикоричная (кумариновая) кислота циклизуется с образованием кумарина (лактонная проба).

Выделение кумаринов. Для выделения различных по строению и свойствам производных кумарина из растительного сырья используют преимущественно органические растворители: метиловый и этиловый спирты, хлороформ, метилен-хлорид, диэтиловый и петролейный эфиры. Агликоны из смеси возможно отделить с помощью неполярных растворителей (хлороформ, бензол, эфиры). Часто сырье предварительно очищают от липофильных веществ петролейным эфиром, а затем кумарины экстрагируют хлороформом. Кумарины как малополярные ненасыщенные соединения хорошо сорбируются гидрофильными сорбентами, что также используется для очистки и разделения смеси кумаринов на отдельные компоненты. Для этой цели применяют алюминия оксид, силикагель, реже полиамид и сефадексы.

Качественные реакции. Для обнаружения кумаринов в ЛРС используют их свойства как лактонов, способность флуоресцировать в УФ-свете, давать окрашенные растворы с диазосоединениями и микросублимацию.

В качестве реагентов в реакции азосочетания обычно применяют диазотированные сульфаниловую кислоту, n-нитроанилин и сульфаниламид. Продукты взаимодействия кумаринов с этими реактивами имеют устойчивую окраску, которая в зависимости от строения кумаринового производного

идиазореагента может изменяться от оранжевой до красно-коричневой. Однако эта реакция не специфична для кумаринов, поскольку в нее вступают

идругие фенольные соединения.

Хроматографический анализ. Для обнаружения кумаринов в растительных экстрактах используют метод ТСХ. Обычно в качестве подвижной фазы используют гексан, эфир или хлороформ в комбинации с более полярным растворителем, что позволяет разделить кумарины в смеси. Стандартными системами для разделания агликонов является органическая фаза смеси толуола с эфиром (1:1), насыщенная 10 %-ным раствором 10 %-ной кислоты уксусной, для гликозидов — этилацетат—кислота муравьиная—кислота уксусная ледяная—вода (100:11:11:26). С типовой ТСХ кумаринов можно ознакомиться на цв. вкл. IV, рис. 1.

Количественное определение. Для количественного определения кумаринов в ЛРС единого метода не существует. Разработаны методики с использованием титриметрического, полярографического, спектрофотометрического, хромато-спектрофотометрического, флуорометрического методов.

Биологическая активность. Для кумаринов характерна фотосенсибилизирующая (плоды псоралеи, амми большой, листья смоковницы), спазмолитическая (плоды пастернака, корни вздутоплодника сибирского и горичника горного), Р-витаминная (семена каштана) активность. В чистом виде они проявляют антикоагулирующее (дикумарол), антимикробное (умбеллиферон), эстрогенное (куместролы клевера), противоопухолевое (остол) действие.

Некоторым кумаринам присущи инсектицидные свойства. Кумарины и фурокумарины токсичны для моллюсков и рыб. Кумарин в чистом виде воздействует наркотически на кроликов, обладает гипотензивным и седативным действием на мышей, а также является ядом для овец, собак и лошадей.

Химический анализ ЛРС, содержащего кумарины		9 9

Химический анализ ЛРС, содержащего кумарины

Задание 1. Выделите кумарины из предложенного образца ле карственного растительного сырья для проведения качественных реакций и хро матографического анализа.

Методика. 3,0 г сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 30 мл 95 %-ного спирта и нагревают на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 20 мин. Извлечение фильтруют в горячем виде и к фильтрату добавляют по каплям при постоянном перемешивании 10 %-ный раствор свинца ацетата. При этом бо′льшая часть веществ фенольного характера, обладающая способностью к азосочетанию, осаждается. Еще горячую массу переносят на фильтр, отделяют осадок солей свинца и промывают осадок 3 мл спирта. К охлажденному фильтрату прибавляют 5 мл воды.

Для дальнейшей очистки фильтрат помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл, приливают 20 мл хлороформа и встряхивают. Отделяют нижний хлороформный слой. Хлороформ отгоняют под вакуумом, а остаток в колбе растворяют в 6 мл 95 %-ного спирта. Этот раствор используют для дальнейшего анализа.

Задание 2. Проведите качественные реакции обнаружения кумаринов

вполученном извлечении. Запишите наблюдения, химизм реакций и заключение

влабораторный журнал.

Опыт 1. Лактонная проба. К 2 мл спиртового извлечения прибавляют 5 капель 10 %-ного спиртового раствора калия гидроксида, нагревают на водяной бане в течение 5 мин (при наличии кумаринов раствор желтеет). Содержимое пробирки охлаждают, добавляют 2 мл очищенной воды, хорошо перемешивают, прибавляют 10 %-ный раствор хлористоводородной кислоты до кислой реакции (по лакмусу).

Возникновение опалесценции, помутнение или образование осадка указывает на возможное присутствие кумаринов в сырье.

Реакция основана на способности кумаринов при нагревании в щелочной среде образовывать соли желтого цвета, растворимые в воде. При подкислении раствора образуется кислота кумариновая, которая, замыкаясь, переходит в исходные кумарины, не растворимые в воде:

Опыт 2. Реакция с диазореактивом в щелочной среде. К 2 мл спиртового извлечения прибавляют 5 капель 10 %-ного спиртового раствора калия гидроксида и нагревают на водяной бане в течение 3—5 мин, прибавляют 5 капель свежеприготовленной диазотированной кислоты сульфаниловой.

При наличии кумаринов раствор приобретает коричнево-красную или вишневую окраску.

Реакция основана на способности кумаринов образовывать окрашенные продукты с ароматическими аминопроизводными:

1 0 0 Фенольные соединения. Тема 5. Кумарины

Реактив. 0,45 г кислоты сульфаниловой помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 4,5 мл кислоты хлористоводородной концентрированной, растворяют в 40 мл воды, доводят объем раствора водой до метки. Срок хранения раствора — 1 месяц.

5 мл раствора кислоты сульфаниловой помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, поставленную на лед, прибавляют 2,5 мл 10 %-ного раствора натрия нитрита. Смесь оставляют на льду в течение 5 мин, прибавляют еще 10 мл раствора натрия нитрита и снова оставляют на ледяной бане на 5 мин, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Реактив используют свежеприготовленным и сохраняют на ледяной бане в течение анализа.

Задание 3. Идентифицируйте кумарины методом хроматографии в тонком слое сорбента в сравнении со стандартыми образцами кумаринов. Зарисуйте схему хроматограммы и рассчитайте величины Rf кумаринов. Сделайте заключе ние о качественном составе кумаринов в экстракте.

Сравните полученные вами результаты с типовой хроматограммой, представленной на цв. вкл. IV, рис. 1.

Методика. Спиртовый раствор (см. задание 1) и растворы стандартных образцов кумаринов наносят капилляром на линию старта пластинки, покрытой слоем силикагеля. Пластинку сушат на воздухе в течение 5 мин, затем помещают в камеру со смесью растворителей гексан-ацетон (8:2) или бензол-этилацетат (2:1) и хроматографируют восходящим методом. Кумарины в зависимости от структуры имеют в УФ-свете зеленую, ярко-голу- бую, зеленовато-голубую или фиолетовую флуоресценцию, которая усиливается под действием щелочи (обычно хроматограмму выдерживают в парах аммиака).

Отмечают пятна кумаринов и цвет их флуоресценции на пластинке простым карандашом. Хроматограмму опрыскивают 10 %-ным спиртовым раствором калия (натрия) гидроксида, подсушивают в сушильном шкафу при температуре 110—120 °С в течение 2—3 мин, а затем опрыскивают свежеприготовленным раствором кислоты сульфаниловой диазотированной.

При наличии кумаринов в сырье на хроматограмме появляются яркие пятна от красного до фиолетового цвета.

Задание 4. Определите количество кумаринов в листьях смоковницы обык новенной. Рассчитайте результат и сделайте заключение о соответствии иссле дуемого сырья требованиям ФС 424—99 — «не менее 0,08 % суммы кумаринов в пересчете на псорален».

Методика. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Около 3 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в аппарат Сокслета и экстрагируют смесью растворителей метанол—хлороформ (15:85) в течение 2—3 ч (не менее 15 сливов). Последний слив растворителя должен быть практически бесцветным.

Полученный экстракт упаривают до объема 80—90 мл, охлаждают до комнатной температуры, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки смесью растворителей мета- нол—хлороформ (15 : 85) и перемешивают.

20 мл полученного раствора помещают в делительную воронку вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл воды, затем — 2 г натрия хлорида. Смесь энергично встряхивают в течение 2 мин и дают отстояться до полного разделения фаз. Верхний, водный, слой переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, а хлороформно-метанольный слой вновь обрабатывают 40 мл воды