V_N_Kovalev_Praktikum_po_farmakognozii

Основные термины и понятия		1 1

Вразделе «Микроскопия» указываются основные микроскопические диагностические признаки сырья.

Вразделе «Качественные реакции» приводятся методики химических, микрохимических реакций или идентификации с помощью хроматографии.

Вразделе «Люминесцентная микроскопия» характеризуется цвет люминесценции отдельных клеток и тканей в УФ-свете.

Вразделе «Числовые показатели» регламентируются нормы минимального содержания действующих экстрактивных веществ, а также предельное содержание влаги, золы, частей сырья, утративших естественную окраску, нормы измельченности, частей ЛР, которые не подлежат заготовке, органических

иминеральных примесей.

Вразделе «Количественное определение» приводится методика количественного определения основного вещества, суммы БАВ или биологическая активность, выраженная в единицах действия ЛЕД, КЕД, ГЕД.

Вразделе «Микробиологическая чистота» указывается категория в соответствии с ГФУ.

Вразделе «Упаковка» указываются виды упаковки, используемой для дан-

ного вида сырья — цельного (мешки, тюки и др.) и измельченного (пачки и др.), а также масса (нетто) сырья в единице упаковки.

Для ядовитого и сильнодействующего ЛРС в частной ФС «Хранение» указывается список (А или Б), по которому оно хранится.

В разделе «Срок годности» указывается время, в течение которого сырье при хранении в условиях, предписанных общей статьей ГФ XI «Хранение лекарственного растительного сырья», удовлетворяет требованиям АНД

иможет использоваться по назначению.

Вконце частной ФС указывается фармакологическая группа, к которой относится данное сырье.

Монография на лекарственное растительное сырье в PhEur.

Общие требования к лекарственному растительному сырью изложены в Европейской фармакопее в монографии «Herbal Drugs», полный текст которой с переводом представлен в табл. 3.

Т а б л и ц а 3

Общая монография «Herbal Drugs» из PhEur 3-го издания

* Далее по тексту дословный перевод заменен принятой аббревиатурой ЛРС.

1 2		Введение

Продолжение табл. 3

* В скобках указан номер монографии по PhEur.

Основные термины и понятия		1 3

Окончание табл. 3

Структура частной монографии PhEur. В заглавии приводится английское (во французском варианте PhEur — французское) название лекарственного растительного сырья, например Lime Flower (Липы цветы), или экссудата — Tragacanth (Трагакант). В латинском названии ЛРС в отличие от ГФ ХI на первом месте указывается видовое или родовое название растения, а морфологическая группа сырья — на втором месте.

Общие замечания (анг.— General Notices) предписывают выполнять требования 3-го издания Европейской фармакопеи с указанием (в скобках) порядкового номера соответствующей монографии. Для цветков липы — [0957], для трагаканта — [0532].

1 4 Введение

Иногда указаны активность и применение (Action and use). Например, цветки липы характеризуются как спазмолитическое средство (Antispasmodic).

Определение (Definition). Например, сырьем липы являются соцветия (inflorescence), собранные с деревьев Tilia cordata Miller, Tilia platyphyllos Scop.,

Tilia vulgaris Heyne или смесь этих видов. Если предусмотрен количественный анализ действующих веществ, то в разделе проводят минимально допустимое значение БАВ в процентах или в мл/кг для эфирных масел.

Раздел «Характеристика» (Characters) содержит указания на особенности сырья. Например, цветки липы имеют слабый ароматный запах и слизистый вкус.

Макроскопическое и микроскопическое описания сырья приведены в разделе «Идентификация» (Identification), который включает следующие подразделы:

А. Макроскопический анализ.

В. Микроскопический анализ порошка (сито 355).

С. Качественные реакции и/или тонкослойная хроматография (ТСХ) с обязательным указанием типа хроматографической пластинки, способа приготовления исследуемого раствора (Test solution), раствора сравнения (Referens solution), системы растворителей, хромогенного реактива для обработки хроматограммы и характера окраски или флуоресценции пятен на ТСХ.

Раздел «Испытания» (Tests) включает указания на общие монографии определения: золы; золы, нерастворимой в хлористоводородной кислоте; влажности; примесей и других показателей доброкачественности ЛРС.

Раздел «Количественное определение» (Assay) содержит методики количественного определения БАВ физико-химическими методами, реже — экстрактивных веществ. В разделе иногда приводятся схемы типичных хроматограмм при анализе методами ТСХ, ГЖХ или ВЭЖХ.

Хранение (Storage). Как правило, ЛРС хранят в хорошо закрытой упаковке в защищенном от света месте. Иногда указывают особые условия хранения.

Фармакогностические методы анализа

Потребители используют только стандартное сертифицированное сырье, которое соответствует требованиям АНД по следующим показателям: подлинности, чистоте и доброкачественности. Эти показатели определяют, используя фармакогностический анализ.

Подлинность (идентичность) — соответствие исследуемого объекта названию, под которым он поступил для анализа.

Диагностические признаки — совокупность морфологических, анатомических и химических признаков, которые характерны для объекта изучения и позволяют его идентифицировать (установить подлинность).

Чистота — отсутствие в ЛРС посторонних примесей и вредителей сырья. Доброкачественность — соответствие ЛРС, продуктов и лекарственных

средств из него требованиям стандарта (числовым показателям качества). Фармакогностический анализ состоит из ряда последовательно выпол-

няемых анализов: товароведческого, макроскопического, микроскопического и фитохимического. В некоторых случаях устанавливается биологическая активность сырья (например, для сырья, содержащего сердечные гликозиды).

Лекарственное растительное сырье может поступать для стандартизации в цельном виде, резаным, порошкованным, в фильтр-пакетах, брикетах,

Фармакогностические методы анализа		1 5

гранулах и в виде лекарственных сборов. В каждом конкретном случае приходится использовать определенные методы товароведческого анализа.

Товароведческий анализ включает приемку ЛРС, отбор проб для проведения дальнейших испытаний на содержание примесей, степень измельченности и пораженность сырья амбарными вредителями, определение количества влаги и золы в процентах, действующих или экстрактивных веществ.

Макроскопический анализ используют для установления подлинности лекарственного растительного сырья и некоторых показателей его доброкачественности.

Микроскопический анализ является основным методом идентификации измельченного ЛРС (резаного, дробленого, порошкованного, резано-прес- сованного, в брикетах, гранулах, сборах), а также цельного в случае наличия морфологически сходного ЛРС.

Фитохимический анализ используется для обнаружения действующих и сопутствующих веществ в ЛРС, а также для установления количества биологически активных веществ химическими, физико-химическими и хроматографическими методами.

Химические реакции, применяемые для установления подлинности лекарственного растительного сырья, по технике проведения и характеру результатов разделяют:

—на качественные реакции, которые проводят путем прибавления химического реактива к извлечению из ЛРС; могут проводиться с сублиматом — продуктом возгонки ЛРС ;

—микрохимические реакции, включая чисто химические реакции, которые проводят одновременно с микроскопическим анализом, наблюдая результаты реакции под микроскопом.

Хроматографический анализ использует методы хроматографии для разделения смеси природных соединений с целью их обнаружения или идентификации. Является составной частью фитохимического анализа.

Люминесцентный анализ основан на явлении люминесценции веществ, возбуждаемой УФ-излучением (фотолюминесценция). Используется в микроскопическом и хроматографическом анализе для определения подлинности ЛРС.

Общие требования к фармакогностическому анализу

Отбор проб для анализа. Объективность заключения о подлинности и доброкачественности ЛРС зависит от правильного отбора пробы из общей партии сырья. Последовательность операций изложена в общей фармакопейной статье «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа» (ГФ ХI, вып. 1, стр. 267) и является составной частью раздела ГФ ХI «Методы анализа лекарственного растительного сырья».

NB! Необходимо строго соблюдать все правила взятия средней пробы, предназначенной для фитохимического анализа, чтобы не нарушить естественного соотношения всех частей сырья.

Макроскопический анализ в части идентификации ЛРС по внешнему виду изложен в семи групповых статьях ГФ ХI, где определены основные диагностические признаки для различных морфологических групп сырья (листья, цветки и др.).

Микроскопический анализ. Подготовка образцов и техника выполнения микроскопического анализа изложены в соответствующей теме лаборатор-

1 6		Введение

ного занятия (стр. 30) в соответствии с общей статьей ГФ ХI «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья».

Измерение объектов в микроскопическом анализе. Для измерения величины малых объектов используют микроскопы с окулярным микрометром (рис. 1). Окулярный микрометр представляет собой круглую стеклянную пластинку со шкалой, имеющей длину 1 см и разделенной на 100 частей (позиция а). Оку- ляр-микрометр помещают внутрь окуляра на его диафрагму, для чего предварительно отвинчивают глазную линзу окуляра. В микроскоп виден не только объект, но и деления шкалы окуляр-микрометра.

Рис. 1. Окулярный микрометр и способ его калибровки

Для определения размера объекта в микрометрах следует определить цену одного деления окуляр-микрометра и умножить его на соответствующие цифры, полученные при измерении объекта. Цена деления зависит от увеличения объектива и окуляра микроскопа. Поэтому для каждой комбинации объектива и окуляра определяют цену деления с помощью объективного микрометра.

Объективный микрометр представляет собой предметное стекло, на котором выгравирован миллиметр, разделенный на 100 делений по 10 микрометров в каждом (позиция б ).

Для установления цены деления окуляр-микрометра объективный микрометр помещают на столик микроскопа и добиваются совмещения изображения его шкалы с изображением шкалы окуляр-микрометра (позиция в). Затем совмещают какие-либо начальные штрихи обеих шкал и определяют, сколько делений объектив-микрометра приходится на известное число делений окуляр-микрометра.

Например, 10 делений окуляр-микрометра показывают в точности 15 делений объектив-микрометра, что соответствует 150 мкм. Таким образом, цена одного деления окуляр-микрометра соответствует 15 мкм.

Устьичное число (Stomаta index) — процентное отношение устьиц к общему количеству клеток эпидермиса и трихом на единице площади. Методика определения изложена в теме «Антрахиноны» при анализе листьев сенны.

Точность измерения (ГФУ, раздел 1.2).

Количество вещества и объемы реактивов, используемых в испытаниях, количественных определениях и методиках, должны быть измерены с достаточной точностью. Требуемая степень точности обозначается числом десятичных знаков, приведенных в тексте. Определение точности показано на примерах, представленных в табл. 4:

Температура. Точность измерения температуры указывается аналогично точности измерения массы и объема.

Фармакогностические методы анализа			1 7
Значение рН. Требуемая точность величин
	Т а б л и ц а 4
рН указывается в тех же пределах точности,	Определение точности измерения
как точность измерения массы и объема.
Оборудование и аналитические операции.
Стеклянная мерная посуда должна отвечать
требованиям класса А международных стандар-
тов (ISO).
Аналитические операции, если нет других

указаний, осуществляются при температуре от 15 до 25 °С.

Сравнительные исследования проводят в пробирках из бесцветного прозрачного нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром 16 мм. Сравнивают одинаковые объемы веществ на белом (в случае необходимости – черном) фоне. Испытания проводят в рассеянном свете.

Водяная баня. Если в тексте имеется ссылка на водяную баню, следует использовать кипящую водяную баню при температуре около 100 °С, если не указана специальная температура опыта. Можно использовать и другие способы, если они гарантируют температуру, близкую, но не превышающую 100 °С (или другую указанную температуру).

Степень измельчения и сита. Проволочные сита, применяемые для просеивания измельченных лекарственных средств, в том числе и ЛРС, различают по номерам, выраженным в микрометрах, которые соответствуют номинальному размеру отверстия. Сита делают из проволоки равномерного поперечного сечения (табл. 5).

Т а б л и ц а 5

Характеристика проволочных сит

Порошки различают по степени измельчения, выражаемой размером отверстий (меша) сита в микрометрах, через которое порошок может проходить. При описании порошков используют такие определения, как крупный, среднекрупный, среднемелкий, мелкий и очень мелкий порошки (табл. 6).

При характеристике измельченного ЛРС используют следующие определения: крупноизмельченное сырье имеет размер частиц 4,00 мм, средне-

1 8		Введение

Т а б л и ц а 6

Классификация порошков по размеру их частиц

* В скобках указан номер сита.

измельченное сырье проходит через сито с размером отверстий 2,80 мм, мелкоизмельченное сырье имеет размер частиц менее 2,00 мм.

NB! Измельчать навеску ЛРС следует полностью, без остатка. Отделение грубых, трудно измельчающихся элементов ведет к нарушению естественного соотношения отдельных частей растительного сырья.

Вычисление результатов. Результаты количественных определений должны быть вычислены с точностью на один десятый знак больше, чем указано в АНД, и затем округлены следующим образом: если последняя подсчитанная цифра 5 и более, то предшествующая цифра увеличивается на 1; если последняя цифра 4 или менее, предшествующая цифра остается без изменения.

Если при количественном определении требуется перерасчет на абсолютно сухое сырье или оговорено какое-либо другое условие, то потерю в массе при воздушном высушивании сухого сырья определяют с помощью метода, описанного в ГФ ХI.

В ГФУ оговорено, что определение золы общей, золы сульфатной, растворимых в воде посторонних веществ, содержание влаги, экстрактивных веществ, эфирных масел, дубильных веществ, показателя горечи, гемолитического индекса и количества действующих веществ следует вести на воз- душно-сухое сырье, которое не было специально высушено (если нет других указаний в монографии).

Потеря в массе при высушивании (влажность сырья). При определении потери в массе при высушивании, если не указано другое количество вещества, высушивают 1,0 г вещества или 3—5 г ЛРС в предписанных условиях.

Постоянная масса. Выражение «высушить до постоянной массы» означает, что процесс высушивания должен продолжаться до того момента, когда результаты двух последовательных взвешиваний будут отличаться не более чем на 0,5 мг на 1 г вещества, взятого для определения; второе взвешивание производят после дополнительного высушивания в течение 1 ч в предписанных условиях. Выражение «прокалить до постоянной массы» имеет аналогичное значение.

Определение допустимых пределов. Указанные в АНД допустимые пределы числовых показателей получены в результате общей аналитической практики; в них уже учтены обычные аналитические погрешности, допустимый разброс при производстве, а также ухудшение качества в процессе хранения в пределах, которые считаются приемлемыми.

Приемлемые пределы устанавливают с использованием методов математической статистики. Аналитические результаты, полученные от n последо-

Фармакогностические методы анализа		1 9

вательных измерений, суммируют и далее определяют среднее арифметическое и граничные значения доверительного интервала среднего результата.

Реактивы и растворы. Надежность результатов анализа зависит, в частности, от качества используемых реактивов. Реактивы, описанные в общей статье ГФУ «Реактивы», сопровождаются буквой Р. Подразумеваемая степень их чистоты — не ниже ч. д. а. (analytical grade).

Если для растворов не указан растворитель, то подразумевают водные растворы, приготовленные с использованием воды, которая отвечает требованиям статьи «Вода очищенная». Под термином «дистиллированная» следует понимать «воду очищенную», полученную путем перегонки.

Под названием «этанол» следует понимать спирт этиловый абсолютный; под названием «эфир» — эфир диэтиловый.

Если указан «96 %-ный спирт» без уточнений, то имеется в виду спирт этиловый, который содержит приблизительно 96 процентов этанола по объему. Иные разведения обозначаются термином «спирт» с указанием количества спирта в процентах по объему.

Растворители — это химические соединения или их смеси, способные растворять разные вещества и образовывать с ними однородные системы — растворы.

Кнеорганическим растворителям относят воду очищенную и растворы

вводе минеральных и органических кислот, их солей разной концентрации, сжиженные газы (CO2, фреон).

Корганическим растворителям относятся: углеводороды (гексан, эфир петролейный, толуол и др.); хлоропроизводные углеводороды (метиленхлорид, хлороформ, тетрахлорметан и др.); спирты (метиловый, этиловый, пропиловый, изопропиловый, бутиловый, их растворы в воде и др.); эфиры простые (диэтиловый); эфиры сложные (этилформиат, этилацетат, бутилацетат и др.); кетоны (ацетон, метилэтилкетон); нитропроизводные углеводороды (нитробензол и др.); кислоты (муравьиная, уксусная и др.); амиды (формамид, диметилформамид, или ДМФА).

Многие растворители применяются для экстракции, очистки, хроматографического, качественного и количественного анализа БАВ, перекристаллизации природных соединений и пр. (табл. 7).

Основное требование к растворителю для извлечения действующих веществ из ЛРС — это максимальная экстракция БАВ в сочетании с минимальным выделением сопутствующих веществ, что в значительной мере зависит от природы растворителя. По степени гидрофильности природные вещества разделяют на гидрофильные, которые растворимы в полярных растворителях, и гидрофобные — растворимые в неполярных растворителях. Вещества со смешанными свойствами растворимы в малополярных растворителях.

Кгидрофильным природным соединениям относятся: соли алкалоидов, гликозиды, дубильные вещества, углеводы, соли тритерпеновых сапонинов, водорастворимые витамины. К гидрофобным — жирные и эфирные масла, смолы, жирорастворимые витамины. Смешанную группу составляют основания алкалоидов, агликоны гликозидов, дубильные вещества (низкомолекулярные пищевые танины), стероидные и тритерпеновые сапонины, кумарины, фурокумарины, некоторые витамины.

Вещества полярные, с высоким значением диэлектрической постоянной, хорошо растворяются в полярных растворителях и наоборот. Самыми распространенными растворителями для выделения БАВ являются спиртоводные смеси. Их диэлектрическая постоянная может изменяться в больших преде-

лах, что позволяет таким смесям экстрагировать природные соединения с разной полярностью.

2 0		Введение

Т а б л и ц а 7

Растворители, часто применяемые в фитохимическом анализе

Способы выражения концентраций. В зависимости от контекста термин «процент» (%) может иметь одно из двух значений:

— массовая доля в процентах (мас. д., %) — количество граммов вещества в 100 г конечного продукта;

— объемная доля в процентах (об. д., %) — число миллилитров вещества в 100 мл конечного продукта.

Растворимость. Данные о растворимости означают приблизительную растворимость вещества при температуре 20 °С, если нет других указаний. Она выражается в частях, соответствующих миллилитрам (мл) растворителя, в которых растворим 1 г твердого вещества.

Иногда для обозначения растворимости вещества используются описательные термины (табл. 8).

Температура. Температура выражается в градусах Цельсия (°С).

Кроме конкретных значений температуры используются следующие термины:

вхолодильнике — от 2 до 8 °С;

вхолодном или прохладном месте — от 8 до 15 °С; при комнатной температуре — от 15—25 °С.

Сырье, которое хранится не при комнатной температуре, должно быть

маркировано соответствующим образом.

Хранение. Растительное сырье следует хранить в соответствии с требованиями, изложенными в общей статье ГФ ХI «Хранение лекарственного растительного сырья».

Упаковка должна быть герметичной и не взаимодействовать ни физически, ни химически с растительным сырьем, чтобы не ухудшить его качество.