V_N_Kovalev_Praktikum_po_farmakognozii

Химический анализ ЛРС, содержащего соединения с гликозидной связью		4 1

в растворе 1 : 500 000. Реакции мешает присутствие спирта, танина, щелочи, кислоты азотной, хлора.

Нагрейте колбу и наблюдайте, как окраска слабеет, а при 100 °С совсем исчезает. Охладите клейстер. Окраска восстанавливается.

Запишите в лабораторный журнал свои наблюдения и сделайте вывод. На основе знаний из курса органической химии объясните, почему окраска комп лекса с йодом зависит от температуры?

Опыт 3. Реакция с реактивом Фелинга. К 2 мл крахмального клейстера прибавляют 2 капли водного раствора меди (II) сульфата (раствор А) и 2 капли щелочного раствора сегнетовой соли — калиево-натриевой соли кислоты винной (раствор Б). Наблюдают выпадение голубого осадка меди (II) гидроксида, который с сегнетовой солью образует водорастворимый комплекс синего цвета. Смесь нагревают на водяной бане.

Почему при взаимодействии крахмала с реактивом Фелинга не происходит окисли тельно восстановительная реакция? Запишите объяснение в лабораторный журнал.

Опыт 4. Кислотный гидролиз крахмала. В пробирку помещают 1 мл 0,5 %-ного крахмального клейстера, 10 капель 10 %-ного раствора кислоты серной и нагревают на водяной бане в течение 20 мин. Раствор становится прозрачным.

Каплю гидролизата помещают на предметное стекло и смешивают с 1 каплей раствора йода в калия йодиде. Отсутствие синего окрашивания свидетельствует о полном гидролизе крахмала.

Наличие глюкозы, образовавшейся в результате гидролиза крахмала, доказывают реакцией восстановления Cu2+ (с реактивом Фелинга). Наблюдают постепенное обесцвечивание раствора и образование красно-коричневого осадка меди (I) оксида.

Запишите в лабораторном журнале результаты опыта.

4 2		Тема 2. Соединения с гликозидной связью: полисахариды и гликозиды

Декстрин — Dextrinum

Опыт 5. Реакция с раствором щелочи. 0,1 г декстрина растворяют в 10 %-ном растворе натрия гидроксида.

Декстрины растворяются в растворе щелочи и окрашивают его в желтый цвет.

Опыт 6. Реакция с реактивом Фелинга. К щелочному раствору декстрина (опыт 5) прибавляют 1 мл реактива Фелинга и нагревают смесь на кипящей водяной бане.

Запишите в лабораторном журнале обоснование разной скорости образова ния осадка меди (I) оксида в зависимости от размера молекулы декстрина.

Опыт 7. Взаимодействие со спиртом. К 0,5 мл 5 %-ного раствора декстрина прибавляют 5 мл 96 %-ного спирта. Появляется молочная муть, и постепенно образуется осадок (дегидратация), что отличает декстрины от сахаров.

Запишите в лабораторном журнале ваши наблюдения и вывод.

Целлюлоза — Cellulosa

Опыт 8. Реакция с раствором йода. На порошок целлюлозы наносят пипеткой каплю раствора йода. Целлюлоза окрашивается раствором йода в желтый или коричневый цвет (отличие от крахмала).

Опыт 9. Реакция с йодом в растворе цинка хлорида и калия йодида (хлор- цинк-йод). На кончик шпателя набирают порошок целлюлозы, помещают его на предметное стекло и смачивают реактивом. Целлюлоза окрашивается в синий цвет.

Запишите ваши наблюдения в лабораторный журнал, по результатам опы тов 8 и 9 сделайте вывод о подлинности образца целлюлозы.

Инулин — Inulinum

Опыт 10. Реакция с α-нафтолом (реакция Молиша). На поперечный разрез корня цикория (одуванчика, эхинацеи, девясила или клубней топинамбура) наносят пипеткой 1 каплю 20 %-ного спиртового раствора α-нафтола

икаплю кислоты серной концентрированной.

Стечением времени появляется фиолетовая окраска.

Запишите результаты опыта в лабораторный журнал.

Химический анализ ЛРС, содержащего соединения с гликозидной связью		4 3

Альгиновая кислота — Acidum alginicum

Опыт 11. Реакция с пиридином и меди (II) сульфатом. К 2—3 мл раствора натрия альгината прибавляют 5 капель реактива и по каплям 2 %-ный раствор кислоты серной до исчезновения синей окраски.

В присутствии альгинатов выпадает осадок.

Реактив. Смешивают 1 мл пиридина, 4 мл 10 %-ного раствора меди (II) сульфата и 5 мл воды.

Слизи — Mucilagines

Опыт 12. К 1—2 мл 10 %-ного настоя корня алтея, приготовленного на холодной воде, прибавляют 2 капли раствора натрия гидроксида (или аммиака). Смесь приобретает лимонно-желтую окраску.

Опыт 13. В пробирку наливают 1 мл 10 %-ного настоя корня алтея и прибавляют 2—3 капли кислоты хлористоводородной концентрированной. Образуется желтовато-зеленое окрашивание. К смеси приливают 2 мл спирта. Слизь коагулирует в пористый сгусток.

Опыт 14. К 2 мл раствора, приготовленного для количественного определения полисахаридов подорожника (см. задание 3), прибавляют 2 мл раствора свинца ацетата; выпадает объемный осадок слизи.

Запишите результаты опытов в лабораторный журнал.

Опыт 15. Определите индекс набухания сырья, содержащего слизи, по методике PhEur. Сравните полученный результат с требованиями АНД. Сделайте вывод.

Индекс набухания — это объем в миллилитрах, занимаемый ЛРС и окружающей слизью после набухания сырья в водной среде.

Методика. 1,0 г цельного или измельченного сырья, содержащего слизь, помещают в мерный цилиндр вместимостью 25 мл с притертой пробкой и ценой деления 0,5 мл. Сырье увлажняют 1 мл спирта, добавляют воду до метки и тщательно взбалтывают смесь каждые 10 мин в течение 1 ч для равномерного смачивания сырья. Через 1,5 ч цилиндр вращают вокруг вертикальной оси для того, чтобы осели всплывшие частицы сырья. Через 2 ч измеряют объем набухшего сырья с окружающей слизью. Проводят не менее трех определений одновременно. Рассчитывают среднюю величину индекса набухания.

П р и м е ч а н и е. Индекс набухания семян льна: не менее 4 — для цельного сырья, не менее 4,5 — для порошка (сито 710); семян подорожника исфагула (аналог семян подорожника блошного) — не менее 40 для навески 0,1 г измельченного сырья (сито 355); корней алтея (сито 710) — не менее 10; листьев алтея — не менее 12 для навески 0,2 г измельченного сырья (сито 355).

Задание 2. Проведите гидролиз гликозидов.

Опыт 16. Кислотный гидролиз. 1 г измельченных листьев ландыша, содержащих сердечные гликозиды с лабильной α-гликозидной связью, помещают в колбу со шлифом вместимостью 25 мл, прибавляют 10 мл 70 %-ного спирта и нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Фильтруют остывшее извлечение через вату.

2 мл экстракта помещают в пробирку, прибавляют 0,5 мл 1 %-ного раствора кислоты хлористоводородной, нагревают смесь на водяной бане 2— 3 мин. К реакционной смеси прибавляют несколько капель 10 %-ного раствора натрия гидроксида и 1 мл реактива Фелинга. Повторно нагревают содержимое пробирки на водяной бане в течение 2 мин. Параллельно проводят опыт с извлечением, которое не подвергалось гидролизу.

4 4		Тема 2. Соединения с гликозидной связью: полисахариды и гликозиды

Образовавшиеся в результате гидролиза сахара восстанавливают реактив Фелинга с образованием осадка меди (I) оксида. В спиртовом извлечении из листьев ландыша содержатся свободные сахара в количестве, недостаточном для окислительно-восстановительной реакции.

Пронаблюдайте за образованием осадка и запишите в лабораторный журнал его цвет.

Опыт 17. Ферментный гидролиз. Смочите горчичник или горчичный порошок в фильтр-пакете водой с температурой 38—40 °С. Приложите пакет или горчичник к руке в области запястья.

Отметьте появление через некоторое время запаха горчичного эфирного масла и раздражение кожи. Запишите химизм энзиматического гидролиза синигрина в лабораторный журнал:

Задание 3. Выделите полисахариды из лекарственного растительного сырья.

Для выполнения задания используют извлечение, которое получают в процессе количественного определения полисахаридов в листьях подорожника.

Методика (ст. 20 ГФ ХI). Аналитическую пробу сырья измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 2 мм. Около 10 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, прибавляют 200 мл воды, колбу присоединяют к обратному холодильнику и кипятят при перемешивании на электрической плитке в течение 30 мин. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя первый раз 200 мл, второй раз — 100 мл воды. Водные извлечения объединяют, центрифугируют с частотой вращения 5000 об/мин в течение 10 мин, декантируют в мерную колбу вместимостью 500 мл через 5 слоев марли, вложенной в стеклянную воронку диаметром 55 мм и предварительно промытой водой. Фильтр промывают водой и доводят объем раствора водой до метки (раствор А).

25 мл раствора А помещают в колбу вместимостью 200 мл, прибавляют 75 мл 96 %-ного спирта, перемешивают, подогревают на водяной бане в течение 3 мин для лучшей коагуляции осадка. Появляются хлопьевидные сгустки, которые образуют осадок при отстаивании. Осадок представляет собой сложный комплекс полисахаридов, связанных с белками и минеральными веществами.

Осадок фильтруют через бумажный фильтр и делят на две части для обнаружения восстанавливающих и кислых моносахаридов.

Задание 4. Установите качественный моносахаридный состав полисахари дов. Результаты реакции и вывод запишите в лабораторный журнал. Подумайте, почему реакция на восстанавливающие сахара проводится после гидролиза по лисахаридов.

Опыт 18. Обнаружение восстанавливающих моносахаридов. Половину осадка (см. задание 3) переносят в колбу вместимостью 25 мл, перемешивают

Химический анализ ЛРС, содержащего соединения с гликозидной связью		4 5

с 5 мл кислоты хлористоводородной разведенной (или 10 мл 10 %-ного раствора кислоты серной) и нагревают на водяной бане в течение 20 мин. К охлажденному гидролизату прибавляют 10 мл реактива Фелинга и нагревают на водяной бане в течение 5 мин. Появляется кирпично-красный осадок меди (I) оксида.

Опыт 19. Обнаружение кислых моносахаридов. Вторую часть осадка растворяют в 5 мл 0,1 моль/л раствора натрия гидроксида. К 1 мл полученного раствора прибавляют 0,25 мл 0,5 %-ного раствора карбазола и 5 мл кислоты серной концентрированной, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин.

Появляется красно-фиолетовая окраска при наличии кислоты галактуроновой или глюкуроновой.

Реактив. 0,5 г карбазола растворяют в очищенном 95 %-ном спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл и доводят объем раствора этим же спиртом до метки.

Задание 5. Проведите хроматографический анализ моносахаридов в семе нах подорожника блошного методом, описанным для семян подорожника исфагу ла — Plantago isphagula (Plantago ovata) и адаптированным к лабораторным заня тиям. Зарисуйте схему хроматограммы, рассчитайте величину Rf моносахаридов,

сделайте заключение.
Методика. 10 мг порошка семян	подорожника (сито	355) помещают
в ампулу, прибавляют 5 мл (230 г/л)	раствора кислоты	трихлоруксусной

и перемешивают. Ампулу запаивают и нагревают смесь в сушильном шкафу при 120 °С в течение 1 ч. Гидролизат центрифугируют, переносят надосадочную жидкость в колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 10 мл воды и выпаривают раствор под вакуумом до сухого остатка (азеотропная перегонка). Растворяют осадок в 10 мл воды и снова выпаривают под вакуумом досуха. Растворяют остаток в 2 мл спирта.

Приготовление растворов стандартных образцов: 10 мг арабинозы растворяют в минимальном количестве воды и приливают к 10 мл спирта. Так же готовят стандартные образцы ксилозы и галактозы.

На линию старта хроматографической пластинки размером 7×15 см, покрытой слоем силикагеля, наносят по 10 мкл гидролизата и растворов стандартных образцов арабинозы, ксилозы и галактозы. Пластинку помещают

вкамеру со смесью растворителей вода—ацетонитрил (15 : 85) и хроматографируют. Когда фронт растворителей пройдет 15 см от линии старта, пластинку вынимают, высушивают на воздухе, обрабатывают реактивом и нагревают

всушильном шкафу при 100 °С в течение 5 мин. Анализируют при дневном свете.

Вгидролизате семян подорожника обнаруживают два красноватых пятна (арабиноза и ксилоза) и желтое пятно (галактоза), совпадающих с пятнами стандартных образцов.

Реактивы: 3 г кислоты фталевой и 0,3 г кислоты аминогиппуровой растворяют

в100 мл спирта; или 1,23 г n-анизидина (анилина) и 1,66 г кислоты фталевой растворяют в 100 мл спирта.

Задание 6. Определите количество полисахаридов в листьях подорожника большого гравиметрическим методом, используя извлечение, полученное при выполнении задания 3. Произведите расчет, сравните результат с требованиями АНД. Сделайте заключение о доброкачественности анализируемого образца листьев подорожника.

4 6 Тема 2. Соединения с гликозидной связью: полисахариды и гликозиды

Методика (ст. 20 ГФ ХI). 25 мл раствора А, полученного при выполнении задания 3, помещают в центрифужную пробирку, прибавляют 75 мл 96 %-ного

спирта,	перемешивают, подогревают на водяной бане	до 30 °С в течение
5 мин.	Через 1 ч содержимое центрифугируют с	частотой вращения

5000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость фильтруют под вакуумом при остаточном давлении 13—16 кПа через высушенный до постоянной массы при температуре 100—105 °С стеклянный фильтр ПОР 16 диаметром 40 мм. Осадок количественно переносят на фильтр и последовательно промывают 15 мл раствора 96 %-ного спирта в воде (3:1), 10 мл ацетона, 10 мл этилацетата. Фильтр с осадком высушивают сначала на воздухе, затем при температуре 100—105 °С до постоянной массы.

Содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье Х, %, вычисляют по формуле

(m2 – m1) · 500 · 100 · 100 Х = ———————————————,

m · 25 · (100 – W)

где m1 — масса фильтра, г;

m2 — масса фильтра с осадком, г;

m— масса сырья, г;

W — потеря в массе при высушивании сырья, %.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

?1. Дайте определение понятия «полисахариды» как группы биологически активных веществ. Приведите классификацию.

2.Дайте определение понятия «гликозиды» как группы биологически активных веществ.

3.Перечислите возможные варианты классификации гликозидов.

4.Приведите примеры гомополисахаридов.

5.Приведите примеры гетерополисахаридов.

6.Напишите формулы: глюкозы, галактозы, фруктозы, кислоты галактуроновой, кислоты альгиновой, амилозы, амилопектина, инулина, реакции гидролиза амигдалина и синигрина.

7.Приведите методы выделения и очистки водорастворимых полисахаридов из растительного сырья.

8.Перечислите физико-химические методы установления строения полисахаридов.

9.Приведите качественные реакции на слизь.

10.На примере корней цикория поясните результаты качественных реакций на крахмал и инулин.

11.Перечислите действующие и сопутствующие БАВ сырья следующих ЛР: алтея, подорожника большого, подорожника блошного, мать- и-мачехи, льна, липы, малины, ламинарии. Укажите их биологическое действие и применение.

12.Какими методами устанавливают молекулярную массу полисахаридов?

13.Как устанавливают качественный моносахаридный состав гликанов?

14.Перечислите методы количественного определения полисахаридов в ЛРС и препаратах.

15.Какие общие особенности строения имеют полисахариды и гликозиды?

16.Какие вы знаете виды гидролиза полисахаридов и гликозидов?

17.Как обнаружить в продуктах гидролиза моносахариды?

18.Объясните механизм действия горчичников.

Макро и микроскопический анализ ЛРС, содержащего полисахариды		4 7

Макро? и микроскопический анализ ЛРС, содержащего полисахариды

Объекты для лабораторного исследования: корни алтея, трава алтея лекарственного, листья подорожника большого, семена подорожника блошного, листья мать-и-мачехи, семена льна, слоевища ламинарии.

Объекты для самостоятельного изучения: трава подорожника блошного, цветки липы, плоды малины, исландский «мох», хлопчатник; источники: пектина (плоды яблони, корнеплоды свеклы); камеди (виды астрагала, абрикос), инулина (корневища топинамбура, корневища и корни эхинацеи пурпурной, корни цикория, корни одуванчика, корневища и корни девясила); тиогликозидов (семена горчицы); цианогликозидов (семена миндаля горького); соединений серы негликозидной природы (лук, чеснок).

КОРНИ АЛТЕЯ — Radices Althaeae

	Задание 1. Срав
	ните по гербарным об
	разцам,рис.2.3, цв. вкл. I,
	рис. 3 и описанию, дан
	ному в табл. 2.1, алтей
	лекарственный и алтей
	армянский. Запишите
	в лабораторный жур
	нал название сырья
	алтея, лекарственных
	растений и семейства
	на русском и латин
	ском языках.
	Задание 2. Изучи
	те по гербарным об
	разцам и описанию,
	приведеному в табли
	це 2.2, хатьму тюринг
	скую и мальву лесную,
	которые по внешнему
	виду напоминают алтей
	лекарственный и отно
	сятся к его возможным
	примесям.
	Напишите русские	Рис. 2.3. Алтей лекарственный (а):
	и латинские названия
		1 — внешний вид растения; 2 — корень; 3 — поперечный срез корня; б — лист
	возможных примесей.
		алтея армянского

4 8		Тема 2. Соединения с гликозидной связью: полисахариды и гликозиды

Т а б л и ц а 2.1

Основные отличия алтея лекарственного и алтея армянского

Т а б л и ц а 2.2

Отличительные признаки алтея лекарственного и сходных видов

Задание 3. Проведите анализ цельных корней алтея, очищенных от пробки, в сравнении со стандартным образцом сырья и корнями алтея, не очищенными от пробки (цв. вкл. I, рис. 3). Запишите, используя схему 12, основные внешние при знаки исследуемого сырья. Обратите внимание на цвет корней и на то, что при разламывании они пылят вследствие большого количества крахмала в клетках.

NB! Обратите внимание, что ст. 64 ГФ XI распространяется на корни алтея, очищенные от пробки,— Radices Althaeae mundata. Кроме того, в медицине применяются корни алтея, не очищенные от пробки,—

Radices Althaeae naturalis (ФС 42-812-73).

Внешние признаки по ст.64 ГФ XI. Корни почти цилиндрической формы или расщепленные вдоль на 2—4 части, слегка суживающиеся к концу, длиной 10—35 см и толщиной до 2 см. Поверхность корня продольно-бороздча- тая с отслаивающимися длинными, мягкими лубяными волокнами и темными точками — следами отпавших или отрезанных тонких корней. Излом в центре зернисто-шероховатый, снаружи волокнистый.

Макро и микроскопический анализ ЛРС, содержащего полисахариды		4 9

Рис. 2.4. Микроскопия корня алтея лекарственного:

а — фрагмент перидермы и коры; б — фрагменты центрального цилиндра; 1 — тонкостенная паренхима с крахмальными зернами; 2 — тангентально вытянутые группы лубяных волокон со слабоутолщенными, целлюлозными или слабоодревесневшими стенками, расположенные прерывистыми концентрическими поясами; 3 — мелкие группы волокон в древесине; 4 — сосуды; 5 — трахеиды; 6 — сердцевинные лучи одно-, реже двухрядные; 7 — клетки со слизью в паренхиме коры и древесины (в воде слизь растворяется, клетки становятся бесцветными и кажутся пустыми); 8 — друзы кальция оксалата

5 0		Тема 2. Соединения с гликозидной связью: полисахариды и гликозиды

Цвет корня снаружи и в изломе белый, желтовато-белый (алтей лекарственный) или сероватый (алтей армянский). Запах слабый, своеобразный. Вкус сладковатый с ощущением слизистости.

Задание 4. Проведите качественные реакции на слизь и крахмал. Результа ты реакций запишите в лабораторный журнал. При смачивании излома или порошка корня раствором натрия гидроксида образуется лимонно-желтое окрашивание (слизь). При нанесении раствора йода на очищенную поверхность корня или излом появляется синее окрашивание (крахмал).

Задание 5. Приготовьте поперечные срезы корня алтея и проведите: а) ре акцию на одревесневшие клеточные оболочки и б) реакцию двойного окрашива ния. Рассмотрите окрашенные препараты под микроскопом при м/у и б/у и зари суйте в лабораторном журнале основные диагностические признаки (рис. 2.4 и цв. вкл. I, рис. 1).

а) Реакция на одревесневшие оболочки: помещают срез в 1 %-ный спиртовый раствор флороглюцина, прибавляют 1 каплю кислоты хлористоводородной концентрированной. Через 1 мин избыток реактива удаляют фильтровальной бумагой и прибавляют 1 каплю хлоралгидрата. Лигнифицированные оболочки клеток приобретают красное окрашивание.

б) Реакция двойного окрашивания: срез корня алтея помещают на 20 мин в раствор железа (III) хлорида, переносят на предметное стекло, реактив удаляют фильтровальной бумагой, добавляют каплю метиленового синего, а затем срез промывают водой. Клетки со слизью окрашиваются в желтый цвет, лубяные волокна приобретают синюю окраску, а сосуды древесины — зеленую. Клетки паренхимы остаются бесцветными.

Задание 6. Изучите числовые показатели, характеризующие доброкачествен ность очищенных корней алтея. Какой гистохимической реакцией можно обнару жить одревеснение корней?

Числовые показатели. Влажность — не более 14 %; золы общей — не более 8 %; золы, нерастворимой в 10 %-ном растворе кислоты хлористоводородной,— не более 0,5 %; деревянистых корней — не более 3 %; корней, плохо очищенных от пробки,— не более 3 %; органической примеси — не более 0,5 %; минеральной примеси — не более 0,5 %.

Числовые показатели по EurPh. Индекс набухания — не менее 10 для измельченного сырья (сито 710); влажность — не более 12 %; золы общей — не более 6 % (для очищенных корней), не более 8 % (для неочищенных корней); побуревших корней — не более 2 %; для очищенных корней допускается не более 2 % пробки.

Задание 7. Известно, что корни алтея применяют как отхаркивающее сред ство. Укажите в лабораторном журнале препараты из корней алтея.

ТРАВА АЛТЕЯ ЛЕКАРСТВЕННОГО — Herba Althaeae officinalis

Задание 1. Запишите в лабораторный журнал название сырья, лекарствен ного растения и семейства на русском и латинском языках.