34, 35 Фаги- транспозоны….. Векторы….

Генная инженерия - это раздел молекулярной генетики, но, главное, − ветвь биотехнологии по созданию рекомбинативных ДНК (рекДНК) из различных видов организмов и вирусов, спо­собных размножаться в реципиентной клетке или организме и детерминировать образование биологически активных веществ, обеспечивающих потребности народного хозяйства, биологии и медицины в частности.

Генную инженерию иногда образно называют индустрией ДНК. Существует твердая убежденность, что уже в ближайшие годы могут быть созданы новые мощности по производству ферментов, незаменимых аминокислот, витаминов, гормонов, антибиотиков, вакцин и других веществ. Индустрия рекомбинантных ДНК открывает практическую возможность эффектив­ного лечения наследственных болезней обмена веществ путем реконструкции дефектных генов. С нею также связывают пер­спективы получения новых высокопродуктивных мясных и молочных пород животных, высокоурожайных сортов расте­ний, устойчивых к вредителям и способных усваивать атмо­сферный азот, что позволит сократить использование пестици­дов, химических удобрений и тем самым улучшить экологиче­скую обстановку на Земле.

Конструирование генов

Конструирование комбинативных генетических структур, де­терминирующих образование биологически активных веществ или других продуктов, основано на использовании двух мето­дов - выделении (вырезании) генов и их синтезе.

Выделение генов. Гены выделяют из геномов про- и эукариот, вирионных геномов и плазмид, содержащих от 3-4 (F-плазмиды, фактор бактериоциногенности) до 15-20 генов (R-плазмиды), способных интегрироваться с клеточным гено­мом и передаваться реципиентным клеткам благодаря наличию пилей (половых ворсинок) и tra-оперонов (англ. transfer - пере­нос). При этом используются особые ферменты рестриктазы (лат. restrictio - разрыв), или эндодезоксирибонуклеазы, рассе­кающие молекулу ДНК на отдельные сегменты с липкими кон­цами, к которым легко присоединяются другие рестриктазные фрагменты.

Первые рестриктазы получил Г. Смит, а применил их как «молекулярные ножницы» для получения генов и составления генных карт Д. Натане, за что они совместно с В. Арбером, от­крывшим механизм рестрикции, были удостоены в 1978 г. Но­белевской премии.

В настоящее время генные инженеры располагают сотнями рестриктаз. Каждая из них расщепляет ДНК независимо от ее происхождения по строго определенным сайтам (участкам) узна­вания нуклеотидных последовательностей. Величина получае­мых при этом фрагментов ДНК зависит от частоты встречаемо­сти сайтов узнавания в молекуле ДНК и ее длины. Так, если сайт узнавания составляет 4 пары нуклеотидов (пн), то он обычно по­вторяется через 256 пн, при длине 5 пн - через 1024, 6 пн - че­рез 4 096 пн, 7 пн - через 16 384 пн, 8 пн - через 65 536 пн. С учетом этого для получения фрагментов ДНК, по величине со­измеримых с генами, естественно, выбирают рестриктазы с ред­ко встречаемыми сайтами узнавания нуклеотидных последова­тельностей. Такой рестриктазой, в частности, является EcoRl, образование которой детерминируется в кишечной палочке плазмидой R1. Специфически распознаваемые ею нуклеотидные последовательности встречаются в молекулах ДНК не чаще, чем через 4000-16 000 пн. Следовательно, фрагмент ДНК, образую­щийся под действием EcoRl, может включать два и более генов (1 ген в среднем содержит 1000-1500 пн).

Полученные гены, однако, не всегда соответствуют функ­ционирующим ввиду того, что сайты расщепления рестриктаз в исходных молекулах ДНК оказываются в их пределах. Это при­водит к дроблению структурных генов или утрате ими регуля-торных последовательностей. В подобных случаях выделенные гены подключают к промоторам или же прибегают к процедуре наращивания недостающих нуклеотидов. Плохо функциони­рующий ген активируют дополнительными вставками аналогич­ных ему генов, что называют тандемной амплификацией (англ. tandem - один за другим, лат. amplificatio - увеличение), а к ге­нам со сдвигом рамки считывания информации добавляют лин­керы (англ. link - связующее звено), чтобы подстроить их под рамку считывания предшествующего гена или его фрагмента.

Успешное использование выделенного гена определяет пре­жде всего реципиентная клетка. Так, гены эукариот, в составе которых, как известно, имеются не содержащие информации интроны, не экспрессируются в клетках прокариот, так как в них не происходят процессинг и сплайсинг и к тому же недеятельными оказываются промоторы. Напротив, экспрессия генов прокариот в бактериях достигается без особых трудностей.

Синтез генов. Таким образом, выделить функционирующие гены рестриктазным дроблением генного материала микробов, клеток животного и растительного происхождения очень труд­но, а получить их из геномов РНК-содержащих вирусов вообще невозможно.

Поэтому для получения генов эукариот и РНК-вирусов был разработан метод синтеза ДНК-копий (транскриптов) на матри­цах клеточной иРНК и вирионной РНК с помощью фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, или обратной транскриптазы. При этом обратную транскриптазу получают из ретровирусов, в частности вирионов птичьего миелобластоза, саркомы Рауса, мышиной лейкемии, и с ее помощью поэтапно катализируют на РНК синтез одной, а затем и другой нити ДНК. Полученные та­ким искусственным путем ДНК-транскрипты на иРНК клеток часто тоже не имеют регуляторных нуклеотидных последова­тельностей, ибо уже изначально просто не воспроизводятся при их транскрипции. Иначе обстоит дело с вириоными РНК. Синте­зированные на них ДНК-транскрипты полностью комплементарны РНК-генам и кодируют аналогичные им генные продукты.

Передача и клонирование генов

На втором этапе генноинженерных работ выделенные и син­тезированные гены с помощью рестриктаз вводят в кольцевые специализированные ДНК-векторы (лат. vector - несущий, ве­зущий) и сшивают (лигируют) их ДНК-лигазой в единую рекДНК, способную проникать в соответствующие клетки и благодаря наличию в векторах специфических ДНК-репликаторов, промоторов и терминаторов размножаться и из­бирательно накапливать генные продукты, что называют клони­рованием молекул ДНК. Выбор вектора определяется также его безвредностью для реципиентной клетки, а системы вектор — хо­зяин в целом - взаимным сродством.

В зависимости от того, в каких клетках реплицируются век­торы, их делят на векторы прокариот, эукариот и челночные, содержащие репликаторы генетически неродственных организ­мов. В генной инженерии их получают от естественных репликонов: плазмид, бактериофагов, фагоплазмид и вирусов.

Чаще всего из этих векторов используются плазмиды бакте­рий, особенно те, которые дают не 4-6 копий, как плазмида pSClOl кишечной палочки, в которую американский ученый С. Коэн впервые ввел фрагмент ДНК из ооцитов шпорцевой ля­гушки, контролирующий синтез рибосомных РНК, и участок ДНК морского ежа, детерминирующий синтез белков-гистонов, а многократно реплицирующиеся и образующие в одной клетке несколько тысяч копий. Примером такой плазмиды может слу­жить ColEl, контролирующая синтез колицина. К ней удалось присоединить R-плазмиды, умеренные фаги и даже гены био­синтеза триптофана, резко увеличив продукцию детерминируе­мых ими белков-ферментов. Удобными векторами для бактерий и других прокариот являются умеренные фаги. Так, in vitro в структуру фага лямбда включают бактериальные гены, ДНК других фагов, ДНК мухи-дрозофилы. В клетки животных гены вносят при помощи векторов, сконструированных на основе полиома-, папилома-, герпес-, адено-, ретровирусов и особенно ви­руса SV-40 и поксвируса осповакцины, в геном которого встраивают около 10% чужеродного генетического материала от его общей массы.

Для растительных клеток вектором могут служить плазмиды Ti Agrobacterium tumofaciens, вызывающие опухоли на корнях растений. В тех случаях, когда подобрать вектор невозможно, прибегают к безвекторной передаче генов путем трансформации. Правда, передать гены таким образом удается только бактериям включая их в питательную среду.

Частота трансформации бактерий прежде всего определяетеся степенью родства нуклеотидного состава ДНК донора и реципи­ента, на основе которого формируется трансформант, но зависш также от рН, ионного и белкового состава питательной среды, температуры культивирования и наличия особого фактора ком­петентности, имеющего структуру полипептида.

Компетентность бактерий, дрожжей, растительных клеток можно увеличить с помощью ферментов, разрушающих полисахаридный каркас оболочек и превращающих их в сферо- и про­топласты. Эффективность трансформации у бактерий возрастает при использовании хлорида кальция и теплового удара, а у эукариот - полиэтиленгликоля, литиевых солей, высоковольтных импульсных электроразрядов, парагриппозного вируса Сендай, содержащего белок слияния.

И, наконец, некоторые возможности передачи генов откры­вает микрохирургия, позволяющая вводить чужеродную ДНК в ядра клеток.

В результате интенсивного развития генной инженерии всего лишь за последнюю четверть XX в. получены клоны многих ге­нов пептидных гормонов, инсулина, интерферона человека, овальбумина, коллагена, глобина, транспортных и рибосомальных РНК, гистонов и некоторых других. Особый интерес для биологии и профилактической медицины представляют вакцины будущего на основе безвредных рекомбинантных вирусов, в геномы которых введены гены широко распространенных инфекционных вирусов, кодирующих один или несколько специфиче­ских антигенов. Все это явилось предпосылкой для создания «банков генов» про- и эукариот на основе эталонных штаммов эшерихий и винных дрожжей.