Раздел 7. Обмен липидов

РАБОТА 11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ОБЩЕГО ХОЛЕСТЕРОЛА В СЫВОРОТКЕ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ЭНЗИМАТИЧЕСКИМ МЕТОДОМ

Цель работы:ознакомиться с одним из самых распространенных в клинической биохимии методов определения холестерола.

Задачи:

• определить содержание общего (свободного и этерифицированного) холестерола в предложенной сыворотке крови;

• проанализировать полученные результаты и сделать вывод.

Принцип метода.При гидролизе эфиров холестеридов холестеролэстеразой образуется холестерол. Общий холестерол (свободный и этерифицированный) окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества пероксида водорода:

В присутствии пероксидазы перекись водорода окисляет фенол, который превращается в бензохинон, имеющий розовый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерола.

Ход работы.В две обычные химические пробирки наливают:

1. в опытную – 0,02 мл сыворотки (или плазмы) крови,

2. в стандартную – 0,02 мл стандартного раствора холестерола.

Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против контроля (кювета с рабочим реагентом) в кюветах с рабочей длиной 5 мм (или 3 мм) при длине волны 490-500 нм.

Окраска проб стабильна в течение 2 часов при условии отсутствия воздействия прямых солнечных лучей.

Результаты:расчёт количества общего холестерола проводят по формуле:

С = Е_о/Е_ст × 5,17 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_ст × 200 (мг/100мл),

где Е_о– экстинкция опытной пробы,

Е_ст– экстинкция стандарта.

Содержание холестерола в сыворотке крови здоровых людей разного возраста колеблется в пределах:

20-29 лет – 3,72-7,11 ммоль/л (144-175 мг/дл),

30-39 лет – 4,27-7,63 ммоль/л (165-295 мг/дл),

40-49 лет – 4,40-8,15 ммоль/л (170-315 мг/дл),

старше 50 лет – 4,58-8,79 ммоль/л (177-340 мг/дл).

Выводы:

РАБОТА 12. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХОЛЕСТЕРОЛА ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Цель работы:ознакомиться с современным и самым распространённым в клинической биохимии методом определения α-холестерола в сыворотке крови.

Задачи:

• определить содержание холестерола липопротеинов высокой плотности (α-холестерола) в сыворотке крови;

• рассчитать холестериновый индекс атерогенности (ХИА);

• проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Принцип метода.Хиломикроны (ХМ), липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП) осаждаются фосфорновольфрамовой кислотой и Mg²⁺и отделяются центрифугированием. Липопротеины высокой плотности (ЛПВП) остаются в надосадочной жидкости (супернатанте) и количество холестерола в них определяется так же, как концентрация общего холестерола, энзиматическим методом.

Ход работы

а) Осаждение ЛПОНП и ЛПНП

В три центрифужные пробирки наливают:

1. в опытную – 0,15 мл исследуемой сыворотки крови,

2. в стандартную – 0,15 мл стандартного раствора холестерола,

3. в контрольную – 0,15 мл дистиллированной воды.

Во все пробирки добавляют по 0,3 мл осаждающего реагента. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и оставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем опытную пробу центрифугируют в течение 15 минут при 3000 оборотах в минуту и прозрачный центрифугат используют для определения холестерола ЛПВП (α-холестерола). Стандартную и контрольную пробы можно не центрифугировать.

б) Определение концентрации α-холестерола

В три обычные химические пробирки (опытную, стандартную и контрольную) аккуратно автоматической пипеткой переносят по 0,2 мл жидкости из соответствующих центрифужных пробирок и добавляют по 2,0 мл рабочего реагента. Реакционную смесь тщательно перемешивают и пробы помещают в термостат на 5 минут при 37°С. Затем измеряют оптическую плотность опытной и стандартной пробы против контроля в кюветах на 5 мм при длине волны 490-500 нм.

Результаты:

1. Концентрацию холестерола ЛПВП (α-холестерола) рассчитывают по формуле:

С = Е_о/Е_ст × 1,29 (ммоль/л) или С = Е_о/Е_ст × 50 (мг/дл),

где Е_ои Е_ст– экстинкции опытной и стандартной проб.

2. Холестериновый индекс атерогенности (ХИА) расчитывают по формуле:

ХИА = (общий холестерол – α-холестерол) / α-холестерол

В норме величина холестеринового индекса атерогенности ≤3,0.

Выводы:

Рекомендации для самостоятельной работы

Подготовить устный ответ на следующие вопросы:

1. Биологическая роль липидов.

2. Классификация липидов.

3. Строение и биологическая роль важнейших липидов тканей человека:

   1. глицеролсодержащие липиды;

   2. сфинголипиды;

   3. стероиды;

   4. незаменимые пищевые факторы липидной природы.

4. Метаболизм липидов:

   1. переваривание и всасывание пищевых липидов: роль системы ферментов и гормонов, строение и биологическая роль желчных кислот, всасывание продуктов гидролиза липидов;

   2. транспорт липидов в организме человека;

   3. метаболизм ТАГ: мобилизация липидов и распад ТАГ в жировой ткани, синтез ацилглицеролов;

   4. обмен жирных кислот: распад жирных кислот (подготовительная стадия β-окисления жирных кислот, цикл Ф. Кноопа, баланс энергии при β-окислении жирных кислот); синтез жирных кислот (общая характеристика синтазы жирных кислот, подготовительная стадия синтеза жирных кислот, основные этапы биосинтеза).

5. Общее понятие об обмене и функциях глицерофосфолипидов.

6. Обмен стероидов. Холестерол: биологическая роль, транспорт, представление о биосинтезе, выведение из организма.

Литература для подготовки:

1. Лекционный материал.

2. Комов В. П., Шведова В. Н. Биохимия. М.: Дрофа, 2004. С. 316-358

3. Березов Т. Т., Коровкин В. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. С. 363-408.