Раздел 8. Обмен простых и сложных белков

РАБОТА 13. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА МОЧЕВИНЫ

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И МОЧЕ ДИАЦЕТИЛМОНООКСИМОВЫМ МЕТОДОМ

Цель работы:ознакомиться с одним из методов определения концентрации мочевины в крови и моче, который широко используется в диагностике для оценки тяжести патологического процесса, для наблюдения за течением заболевания и оценки эффективности проводимого лечения, а также оценки состояния выделительной функции почек.

Задачи:

• определить концентрацию мочевины в сыворотке крови и моче и сделать выводы.

Мочевина является одним из основных конечных продуктов белкового обмена. Азот мочевины составляет около 50% остаточного азота крови. Количество мочевины в сыворотке крови в норме составляет 2,49-8,33 ммоль/л (20-50 мг/дл).

Содержание мочевины в крови возрастает при любых патологических состояниях. Однако наиболее важное диагностическое значение имеет увеличение количества мочевины при заболеваниях почек (в 2-10 раз). Уменьшение количества мочевины в крови наблюдается при болезнях печени (цирроз, гепатиты).

Количество мочевины, выделяемое из организма, свидетельствует об интенсивности белкового обмена. При употреблении пищи, богатой белками, а также при усиленной мышечной работе содержание мочевины в моче увеличивается, а при безбелковой диете – снижается. Количество мочевины в суточной моче подвержено возрастным изменениям и составляет:

у новорожденных – следы;

1-3-месячных – 0,7-1,4 г/сутки;

4-6-месячных – 1,0-3,3 г/сутки;

7-9-месячных – 3,8-5,7 г/сутки;

2-5-летних – 5-11 г/сутки;

14-летних – 20 г/cутки;

у взрослых – 20-35 г/сутки (333-582 ммоль/сутки).

Определение количества мочевины в моче представляет клинический интерес. Увеличение содержания мочевины наблюдается при лихорадочных состояниях, сахарном диабете. Количество мочевины в моче резко снижается при почечной недостаточности, патологиях печени (цирроз, дистрофия, гепатиты), а также при общем и белковом голодании.

Принцип метода. Мочевина взаимодействует с диацетилмоноокси-мом в присутствии тиосемикарбазида и трёхвалентного железа в кислой среде при нагревании с образованием комплексного соедине-ния розово-красного цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины.

1. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови

Ход работы.В три пробирки вносят автоматической пипеткой:

1. в опытную – 0,01 мл свежей негемолизированной сыворотки крови,

2. в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора мочевины,

3. в контрольную – 0,01 мл дистиллированной воды.

Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента и содержимое перемешивают. Пробирки накрывают кусочками фольги, помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут, после чего охлаждают под струёй проточной воды. Затем опыт и стандарт колориметрируют против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Окраска растворов стабильна около 15 минут после снятия проб из бани.

Результаты: количество мочевины в сыворотке крови рассчитывают по формуле:

С = (Е_оп × С_ст) / Е_ст,

где С – количество мочевины в сыворотке крови (ммоль/л);

С_ст– концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л);

Е_оп– оптическая плотность опытной пробы;

Е_ст– оптическая плотность стандартной пробы.

2. Определение концентрации мочевины в моче

Ход работы.Мочу перед анализом разбавляют дистиллированной водой в 25 раз (к 1 мл мочи добавляют 24 мл Н₂О). В три пробирки вносят автоматической пипеткой:

1. в опытную – 0,01 мл разведенной мочи,

2. в стандартную – 0,01 мл стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л),

3. в контрольную – 0,01 мл дистиллированной воды.

Во все пробирки добавляют по 2 мл рабочего реагента, перемешивают, накрывают кусочками фольги и помещают в бурно кипящую водяную баню на 10 минут. После кипячения пробы охлаждают под струёй проточной воды и колориметрируют (опыт и стандарт) против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм).

Окраска растворов стабильна в течение 15 минут после снятия проб из бани.

Результаты:количество мочевины в моче рассчитывают по формуле:

С = (Е_оп × С_ст × А × 1,5) / Е_ст,

где С – количество мочевины в суточной моче (ммоль/сутки);

С_ст– концентрация стандартного раствора мочевины (8,33 ммоль/л);

Е_оп– оптическая плотность опытной пробы;

Е_ст– оптическая плотность стандартной пробы;

А – разведение мочи;

1,5 – коэффициент пересчёта на среднесуточное количество мочи (у мужчин – 1,5 л, женщин – 1,2 л).

Выводы:

РАБОТА 14. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИЛИРУБИНА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ МЕТОДОМ МАЛЛОЙ – ЭВЕЛИНА

Цель работы:ознакомиться с одним из методов оценки характера нарушений пигментного обмена.

Задачи:

• определить количество общего и прямого билирубина в сыворотке крови;

• используя полученные результаты, рассчитать количество непрямого билирубина в сыворотке крови;

• сравнить результаты с нормальными величинами и сделать выводы.

Принцип метода.В основе метода лежит реакция билирубина с диазореактивом Эрлиха (смесью сульфаниловой кислоты и нитрита натрия), в результате которой развивается розово-фиолетовое окрашивание. Хорошо растворимый прямой (конъюгированный) билирубин сразу вступает в эту реакцию. Для определения общего билирубина непрямой (неконъюгированный) билирубин предварительно переводят в растворимое, диссоциированное состояние добавлением детергента.

Ход работы

1. Определение количества общего билирубина в сыворотке крови

В 3 пробирки (опыт, контроль и стандарт) наливают по 1,8 мл реагента № 1. В опытную и стандартную пробирки добавляют автоматической пипеткой по 0,05 мл реагента № 3 и содержимое перемешивают осторожным встряхиванием. Затем в опыт и контроль вносят микропипеткой по 0,1 мл свежей сыворотки крови, а в стандартную пробирку – 0,1 мл стандартного раствора билирубина (реагент № 4). Содержимое каждой пробирки перемешивают и пробы выдерживают при 20-25˚С в течение 5 минут. Далее опыт колориметрируют против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны 555 нм (530-580 нм). Стандартную пробу колориметрируют при тех же условиях против контроля на реактивы (к 1,8 мл реагента № 1 добавляют 0,05 мл реагента № 3).

2. Определение количества прямого билирубина в сыворотке крови

В 2 пробирки (опыт и контроль) наливают по 1,8 мл реагента № 2. В опытную пробу добавляют 0,05 мл реагента № 3 и содержимое осторожно встряхивают. Затем в обе пробирки вносят микропипеткой по 0,1 мл свежей сыворотки крови, перемешивают, и пробы выдерживают 5 минут при 20-25˚С. Опыт колориметрируют против контроля в кюветах с рабочей длиной 5 мм при длине волны 555 нм (530-580 нм).

Результаты: количество общего и прямого билирубина рассчитывают по формуле:

С = (Е_оп × С_ст) / Е_ст,

где С – концентрация билирубина в сыворотке крови (мкмоль/л или мг/дл);

Е_оп– величина оптической плотности опытной пробы;

Е_ст– величина оптической плотности стандартной пробы;

С_ст– концентрация стандартного раствора (85,5 мкмоль/л или 5 мг/дл).

Для расчёта количества прямого билирубина используют величину оптической плотности стандартной пробы, установленную при определении общего билирубина.

Количество непрямого билирубина рассчитывают по разности концентраций общего и прямого билирубина.

Содержание общего билирубина в сыворотке крови, выявленное данным методом, в норме колеблется в пределах 8,5-20,5 ммоль/л. При использовании иных методов физиологическая норма может варьировать в пределах 1,7-20,5 мкмоль/л (0,1-1,2 мг/дл) для общего билирубина, 1,7-17,1 мкмоль/л (0,1-1,0 мг/дл) – непрямого билирубина и 0,86-4,3 мкмоль/л (0,05-0,25 мг/дл) – прямого билирубина.

Определение количества общего, неконъюгированного и конъю-гированного билирубина имеет диагностическое значение и исполь-зуется для дифференциальной диагностики различных типов желтух.

Выводы:

Рекомендации для самостоятельной работы

Подготовить устный ответ на следующие вопросы:

1. Понятие о полноценности белков, азотистый баланс.

2. Переваривание и всасывание белков в ЖКТ: роль HCl в переваривании белков, система ферментов, осуществляющих гидролиз белков (эндопептидазы, экзопептидазы, процесс активирования протеаз в ЖКТ).

3. Внутриклеточный метаболизм.

   1. деградация белков, значение внутриклеточного протеолиза в обмене белков;

   2. общая схема источников и путей расходования аминокислот в тканях, основные пути деградации аминокислот в организме человека: дезаминирование, трансаминирование, декарбоксилирование;

   3. общие пути биосинтеза заменимых аминокислот;

   4. основные способы обезвреживания аммиака: образование аммонийных солей, образование амидов дикарбоновых кислот, метаболизм глутамина, синтез мочевины.

Литература для подготовки:

1. Лекционный материал.

2. Комов В. П., Шведова В. Н. Биохимия. М.: Дрофа, 2004. С. 358-410.

3. Березов Т. Т., Коровкин В. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. С. 409-468.