- •5. Методы выделения и определения белков в растворах.
- •11. Факторы, влияющие на скорость ферментативной реакции.
- •4. Ферменты характеризуются высокой специфичностью:
- •1. Энергетическая функция.
- •2. Пластическая функция.
- •3. Регуляторная.
- •Итоговое уравнение цтк
- •Автономная саморегуляция цтк
- •2) Гепарин
- •Глюкоза – глюкозо-6-фосфат – глюкозо-1-фосфат – удф-глюкоза – гликоген
- •37. Анаэробный гликолиз: молочнокислое брожение. Локализация, реакции, ферменты (классы), регуляция, энергетический баланс, биологическая роль.
1. Энергетическая функция.
ЦТК - конечный этап БО, в котором окисляются унифицированные соединения различного происхождения.
2. Пластическая функция.
Поскольку ЦТК «питается» субстратами различного происхождения, то он может быть источником углеродных скелетов для различных веществ.
ЩУК Цитрат синтез ЖК, т. е. избыток углеводов депонируется в виде нейтрального жира.
Сукцинил КоА синтез ГЛУ, АРГ, ПРО, ГИС.
-кетоглутарат синтез гема (Hb, цитохромы, каталаза, пероксидаза).
ГНГ (образование Гл из неуглеводных компонентов).
3. Регуляторная.
Перекачка субстратов из одного в другой.
Регуляция ЦТК. 1) ретроингибирование; 2) путем изменения концентрации субстрата на входе ЦТК; 3) аллостерическая регуляция (с помощью НАД, НАДН2, АТФ); 4) ионная (pH, [Ca2+]).
ЦТК связан с предшествующими стадиями энергетического обмена (гликолиз, окисление ЖК и АК), поэтому механизмы регуляции этих процессов будут справедливы и для ЦТК:
1) ретроингибирование; 2) путем изменения концентрации субстрата на входе ЦТК; 3) аллостерическаярегуляция (с помощью НАД, НАДН2, АТФ); 4) ионная (pH, [Ca++]).
Так как цикл Кребса начинается со стадии ЩУК + ацетил КоА, то эти метаболиты и управляют интенсивностью ЦТК. Первым регуляторным фактором является концентрация ЩУК, которая в основном образуется из ПВК, ацетил КоА в принципе тоже:
+CO2 -CO2
ЩУК <----- ПВК ------> ацетил КоА
ПВК же образуется из углеводов (Гл), поэтому при диабете или углеводном голодании наблюдается недостаток ПВК, а значит и ЩУК и ЦТК блокируются. Ацетил-КоА не является лимитирующим субстратом, т. к. в основном образуется при окислении ЖК.
Но в то же время ЩУК - конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы, поэтому при избытке ЩУК, ЦТК блокируется на 6 стадии (так называемое «щуковое торможение»). Это торможение можно убрать ГЛУ, который переаминирует ЩУК в АСП.
Второй регуляторный фактор - концентрация НАД и НАДН2. В живых системах концентрация НАД + НАДН2 = const. Любые факторы, ведущие к увеличению НАД.Н2 (гипоксия, алкогольная интоксик5ация) и дефициту НАД+ блокирует ЦТК. Следовательно увеличение концентрации НАД+ при активной работе ДЦ стимулирует ЦТК.
Так как АТФ является косвенно конечным продуктом ЦТК, то ее избыток блокирует ЦТК, а значит АДФ стимулирует ЦТК. (АДФ рассматривается как аллостерический активатор изоцитратдегидрогеназы).
Стимулятором ЦТК является также кислород, потому что он стимулирует распад АТФ.
Нормальная концентрация Ca2+ в клетке 10-7 моль. При увеличении концентрации кальция до 10-6 моль активируются дегидрогеназные реакции: пируватДГ, изоцитратДГ, альфа-КГДГ, а значит и ЦТК.
Цикл Кребса активируется при сердечной недостаточности. Это объясняется тем, что миокард не может самостоятельно убрать избыток Ca2+ и эту роль берут на себя митохондрии, возрастает потребность в кислороде.
25. В организме существует 3 пути потребления и утилизации кислорода:
1 путь - 90-95% O2 идет на митохондриальное окисление.
путь - 5-10% идет на микросомальное окисление (в печени при поступлении больших количеств токсинов - 40%).
3 путь - перекисное окисление (2-5%).
Тканевое дыхание – это последовательность окислительно-восстанови-тельных реакций, протекающих во внутренней митохондриальной мембране с участием ферментов дыхательной цепи. Дыхательная цепь имеет чёткую структурную организацию, её компоненты формируют дыхательные комплексы, порядок расположения которых зависит от величины их редокс-потенциала (рис.5.1). Количество дыхательных цепей в отдельно взятой митохондрии из клеток разных тканей неодинаково: в печени – 5000, в сердце – около 20 000, следовательно, миокардиоциты отличаются более интенсивным дыханием, чем гепатоциты.
Субстраты тканевого дыхания подразделяются на 2 группы:
НАД-зависимые – субстраты цикла Кребса изоцитрат, α-кетоглутарат и малат. Это также пируват, гидроксибутират и β–гидрокси-ацил~КоА, глутамат и некоторые другие аминокислоты. Водород от НАД-зависимых субстратов c помощью НАД-зависимых дегидрогеназ передаётся на I-й комплекс дыхательной цепи.
ФАД-зависимые – сукцинат, глицерол-3-фосфат, ацил~КоА и некоторые другие. Водород от ФАД-зависимых субстратов передаётся на II-й комплекс дыхательной цепи.
При дегидрировании субстратов НАД-зависимыми дегидрогеназами образуется восстановленная форма НАД (НАДH∙H+). НАДH∙H+ может образовываться не только в митохондриях, но и в цитозоле клетки при протекании определённых процессов метаболизма. Однако цитоплазматический кофермент не может проникать в митохондрии. Водород восстановленного кофермента должен быть сначала перенесен на субстраты, которые могут проникать в митохондрии. НАДH∙H+ затем окисляется 1-м комплексом дыхательной цепи. Рассмотрим работу этого комплекса.
26. Митохондриальная ДЦ осуществляется в митохондриях. В основе окисления реакции лежит электронное восстановление О2. Происходит при участии комплексов ДЦ. Дыхательная цепь – форма реализации биологического окисления.
I комплекс цепи тканевого дыхания – НАДH∙H+-убихинон-оксидодуктаза.
Первый комплекс является самым большим в дыхательной цепи (представлен 23-30 субъединицами). Он катализирует перенос водорода от НАДH∙H+ на убихинон (рис. 5.1 и рис. 5.3). В его состав входят кофермент ФМН (флавинмононуклеотид) и железосерные белки, содержащие негеминовое железо. Функция этих белков заключается в разделении потока протонов и электронов: электроны переносятся от ФМН∙Н2 к внутренней поверхности внутренней мембраны митохндрий (обращенной к матриксу), а протоны – к внешней поверхности внутренней мембраны и затем высвобождаются в митохондриальный метрикс.
При транспорте протонов и электронов редокс-потенциал первого комплекса снижается на 0,38 v, что вполне достаточно для синтеза АТФ. Однако в самом комплексе АТФ не образуется, а высвобождающаяся в результате работы комплекса энергия аккумулируется (см. ниже образование электро-химического потенциала) и частично рассеивается в виде тепла. По своему строению ФМН – мононуклеотид, в котором азотистое основание представлено изоаллоксазиновым ядром рибофлавина, а пентозой является рибитол (иными словами, ФМН – это фосфорилированная форма витамина В2).
Функция ФМН заключается в акцепции 2 атомов водорода от НАДH∙H+ и передачи их железосерным белкам. Водород (2 электрона и 2 протона) присоединяется к атомам азота изоаллоксазинового кольца, при этом происходит внутримолекулярная перегруппировка двойных связей с образованием промежуточного семихинона – соединения свободнорадикальной природы (на схеме представлено суммарное уравнение реакции, где R – остальная часть молекулы)
II комплекс цепи тканевого дыхания – сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза.
Этот комплекс имеет меньшую молекулярную массу и также содержит железосерные белки. Сукцинат-убихинон-оксидоредуктаза катализирует перенос водорода от сукцината на убихинон. В состав комплекса входит кофермент ФАД (флавин-аденин-динуклеотид) и фермент сукцинатдегидрогеназа, который является одновременно ферментом цикла Кребса. Ацил~SКоА, 3-фосфо-глицерат и диоксиацетон фосфат также являются ФАД-зависимыми субстратами тканевого дыхания и с помощью этого кофермента контактируют со вторым комплексом.
Энергия включения водорода субстратов во II комплекс цепи тканевого дыхания рассеивается в основном в виде тепла, так как на этом участке цепи редокс-потенциал снижается незначительно и этой энергии для синтеза АТФ мало.
Процесс восстановления ФАД протекает аналогично таковому ФМН.
Цитохромоксидаза имеет высокую степень сродства к кислороду и может работать при его низких концентрациях.
аа3 - состоит из 6 субъединиц каждая из которых содержит гем и атом меди. 2 субъединицы составляют цитохром а, а остальные 4 относятся к цитохрому а3. Между НАД и ФП, b-c, a-a3 имеет место max перепад ОВП. Эти пункты являются местом синтеза АТФ (местом фосфорилирования АДФ).
III комплекс цепи тканевого дыхания – убихинол-цитохром С-оксидоредуктаза. В состав III комплекса входят цитохромы b и с1, относящиеся к группе сложных белков хромопротеинов. Простетическая группа этих белков окрашена (chroma – краска) и близка по химическому строению к гему гемоглобина. Однако в противоположность гемоглобину и оксигемоглобину, в которых железо должно быть только в 2-х валентной форме, железо в цитохромах при работе дыхательной цепи переходит от двух- к трёхвалентному состоянию (и обратно).
Как видно из названия, III комплекс переносит электроны от убихинола на цитохром С. Вначале электроны поступают на окисленную форму цитохрома b (Fe3+), который при этом восстанавливается (Fe2+), затем восстановленный цитохром b передаёт электроны окисленной форме цитохрома с, который также восстанавливается и, в свою очередь, передаёт электроны цитохрому С.
IV комплекс дыхательной цепи – цитохром С-оксидаза. Комплекс назван оксидазой из-за способности непосредственно взаимодействовать с кислородом. У млекопитающих этот крупный (~ 200 kD) трансмембранный белок состоит из 6-13 субъединиц, из которых некоторые кодируются митохондриальной ДНК. В состав IV комплекса входят 2 хромопротена – цитохром а и цитохром а3. В отличие от других цитохромов, цитохромы а и а3 каждый содержат не только атом железа, но и атом меди. Медь в составе этих цитохромов при транспорте электронов также попеременно переходит в окисленное (Cu2+) и восстановленное (Cu+) состояние.
Цитохром с-оксидаза катализирует одноэлектронное окисление 4-х восстановленных молекул цитохрома с и при этом одновременно осуществляет полное (4-х электронное) восстановление молекулы кислорода:
4 цитохрома с (Fe2+) + 4 H+ + O2 => 4 цитохрома с (Fe3+) + H2O
Протоны для образования молекул воды поступают из матрикса. Следует заметить, что эта реакция весьма сложна и протекает через промежуточные стадии образования свободных радикалов кислорода.
Окислительно-восстановительный потенциал IV комплекса является самым большим (+0,57 v), его энергии вполне достаточно для синтеза 3-х молекул АТФ, однако большая часть этой энергии используется на «перекачивание» протонов из матрикса митохондрий в межмембранное пространство. В связи с активным транспортом протонов цитохром с-оксидаза получила название «протонного насоса».
Таким образом, тканевое дыхание представляет собой процесс транспорта электронов и протонов от НАД- или ФАД-зависимых субстратов на кислород, а также протонов, поставляемых матриксом митохондрий. При транспорте падает редокс-потенциал, что сопровождается высвобождением заключённой в субстратах тканевого дыхания энергии. Полное восстановление молекулярного кислорода воздуха в дыхательной цепи сопровождается образованием воды.
Кофермент Q или убихинон - гидрофобное соединение, является компонентом клеточных мембран, содержится в большой концентрации, относится к группе витаминов. относится к группе витаминов. Убихинон – небольшая липофильная молекула, по химическому строению представляющая собой бензохинон с длинной боковой цепью (число изопреноидных единиц колеблется от 6 у бактерий до 10 у млекопитающих). В дыхательной цепи коэнзим Q является своеобразным депо (пулом) водорода, который он получает от различных флавопротеинов. Липофильный характер молекулы убихинона обуславливает его способность свободно перемещаться в липидной фазе митохондриальной мембраны, перехватывая протоны и электроны не только от I и II комплексов дыхательной цепи, но и захватывая из митохондриального матрикса протоны. При этом убихинон восстанавливается с образованием промежуточного свободнорадикального продукта – семихинона .
Восстановленная форма убихинона – убихинол – передаёт протоны и электроны на III комплекс дыхательной цепи.
НАД+. Этот кофермент является динуклеотидом (никотинамид-аденин-динуклеотид): в состав одного нуклеотида входит витамин РР (никотинамид), другой представляет собой АМФ. Способность кофермента играть роль промежуточного переносчика водородов связана с наличием в его структуре витамина РР. В электронно-протонной форме процесс обратимого гидрирования-дегидрирования может быть представлен уравнением (R- остальная часть кофе
НАДH∙H+ может образовываться не только в митохондриях, но и в цитозоле клетки при протекании определённых процессов метаболизма. Однако цитоплазматический кофермент не может проникать в митохондрии. Водород восстановленного кофермента должен быть сначала перенесен на субстраты, которые могут проникать в митохондрии. Такими «Н2-переносящими субстратами» являются:
Оксалацетат → малат
Ацетоацетат → β-гидроксибутират
Дигидроксиацетон фосфат → глицерол-3-фосфат
НАДH∙H+ затем окисляется 1-м комплексом дыхательной цепи.
27. Транспорт электронов в дыхательной цепи сопряжён (связан) с образованием протонного градиента, необходимого для синтеза АТФ. Этот процесс называется окислительным фосфорилированием. Иными словами, окислительное фосфорилировние – это процесс, в котором энергия биологического окисления превращается в химическую энергию АТФ. Свободная энергия электрохимического протонного градиента митохондриальной мембраны используется для синтеза АТФ с помощью протон-переносящей АТФ-синтазы (она также называется протонным насосом, АТФ-азой, F1Fo-АТФ-азой, V комплексом дыхательной цепи).
АТФ-синтаза является самым крупным, по форме напоминающим гриб, структурным компонентом внутренней митохондриальной мембраны. АТФ-синтаза представлена 2 большими полиферметными белками - F1 (шляпка гриба) и Fo (ножка), каждый из которых, в свою очередь, состоит из нескольких неоднородных полипептидов.
Ингибиторы дыхательной цепи являются ядами. Они в равной степени тормозят и дыхание, и фосфорилирование, соотношение Р/О при этом не изменяется. Наиболее популярными являются следующие ингибиторы: ротенон (растительный токсин, применяемый индейцами Амазонии при ловле рыбы, а также используемый в качестве инсектицида), амитал (аминобарбитал – производное барбитуровой кислоты), антимицин А (антибиотик) и цианиды. Ротенон и амитал тормозят перенос водорода от ФМН к убихинону; антимицин А тормозит транспорт электронов от цитохрома b к цитохрому с1; CN-, CO, H2S – ингибиторы цитохромоксидазы
Теория Митчелла, м-м генерации протонного потенциала
Движение электронов через электронтраспортную систему дыхательных ферентов сопровождается одновременно «перекачиваем» протонов из матрикса в межмебранное пространство. Эта передислокация протонов осуществляется I, III и IV комплексами дыхательной цепи. Английский биохимик Питер Митчелл предложил рассматривать внутреннюю мембрану митохондрий как конденсатор, который со стороны матрикса заряжается отрицательно (благодаря направленному току электронов), а со стороны межмембранного пространства – положительно. Следовательно, при тканевом дыхании совершается осмотическая работа по концентрации протонов в межмембранном пространстве и возникает разность электрических потенциалов, т.е. генерируется электро-химический (или протонный) потенциал:
Δ μН+ = Δ Ψ – (-)ΔрН+
Электрохимический Мембранный Градиент рН
градиент рН потенциал
Градиент ΔрН+ имеет отрицательное значение, поскольку измерение проводится от внутренней поверхности мембраны, имеющей более отрицательную величину, к наружной. В целом Δ μН+ имеет положительное значение, равное +0,224v.
Внутренняя мембрана не может заряжаться сколь угодно долго. Если продолжить аналогию с конденсатором, то перезарядка приводит к «пробою», т.е. разрядке. Роль разряжающего устройства выполняет АТФ-синтаза – V комплекс дыхательной цепи.
Энергетический обмен играет ведущую роль в жизнедеятельности организмов, т. к. все функции организма энергозависимы. Систему механизмов, обеспечивающих стабильный уровень субстратов энергообмена называют энергетическим гомеостазом.
Одним из механизмов поддержания постоянного уровня АТФ в клетке, является наличие мегамитохондрий, которое дает большое преимущество.
Если один участок клетки плохо снабжается кислородом, то при помощи мегамитохондрий энергия Н+ транспортируется в этот участок и восполняет недостаток АТФ.
Энергетический обмен играет ведущую роль в жизнедеятельности организмов, т. к. все функции организма энергозависимы. Систему механизмов, обеспечивающих стабильный уровень субстратов энергообмена называют энергетическим гомеостазом.Одним из механизмов поддержания постоянного уровня АТФ в клетке, является наличие мегамитохондрий, которое дает большое преимущество.Если один участок клетки плохо снабжается кислородом, то при помощи мегамитохондрий энергия Н+ транспортируется в этот участок и восполняет недостаток АТФ.
Разобщение окисления и фосфорилирования.
Присутствие во внутренней митохондриальной мембране агентов (ионофоров), увеличивающих их проницаемость для Н+, разобщает окислительное фосфорилирование от процесса транспорта электронов, поскольку при этом нарушается генерирование электро-химического потенциала и, следовательно, синтез АТФ. ДНФ является липофильной слабой кислотой, поэтому легко проходит через мембрану (снаружи внутрь митохондрии), ослабляя естественный ток протонов, идущий в противоположном направлении.
Путь транспорта электронов, не связанный с синтезом АТФ, называется свободным, нефосфорилирующим, окислением. При свободном окислении энергия не аккумулируется, а высвобождается в виде тепла. Это имеет физиологическое значение при охлаждении организма.
Частичное разобщение окисления и фосфорилирования наблюдается при многих заболеваниях, так как митохондрии являются наиболее чувствительными клеточными органеллами к действию различных повреждающих факторов. Нарушение их структуры, приводящее к частичному или полному распаду внутренней митохондриальной мембраны, неизбежно будет способствовать обратному току протонов и нарушать энергопродукцию. Поэтому особое значение приобретает стабилизация митохондриальных мембран биоантиоксидантами (витаминами Е, А и аскорбатом) при любой патологии.
В ряде случаев некоторые пункты фосфорилирования могут «выключатся» - такое состояние называется разобщением окислительного фосфорилирования - и в этом случае P/O снижается: для НАД-зависимых субстратов - ниже 3; для ФАД-зависимых субстратов - ниже 2-ух.
И исходя из 1-го закона термодинамики в разобщенных митохондриях увеличивается теплообразование. (Это происходит за счет того, что та энергия электронов, которая должна была быть использована для синтеза АТФ в «выключенном» пункте фосфорилирования, рассеивается в виде тепла).
Процесс разобщения окислительного фосфорилирования лежит в основе лихорадки, вызванной бактериями, вирусами и другими агентами. Разобщение резко усиливается при охлаждении организма. Работа митохондрий при «выключенных» всех пунктах фосфорилирования называется сопряженной, в противном, выше описанном случае, разобщенной и дыхание при этом называется свободным. В качестве разобщителей окислительного фосфорилирования выступают слабые гидрофобные кислоты (ЖК), тиреоидные гормоны, лекарства(дикумарин, динитрофенол). ДЦ имеет механизмы шунтирования: сброс электронов и протонов по протяжению с НАД на цитохромы, или с НАД на межмембранные дегидрогеназы, на наружную мембрану и гладкую ЭПС (микросомальную цепь).
Такой перенос характерен для печени. При воздействии какого-либо блокатора, возникает блок в 1-ом комплексе ДЦ, происходит накопление НАД.Н2 и становится реальной угроза гипоксии, печень может погибнуть. Чтобы этого не произошло происходит сброс НАД.Н2 с митохондрий ДЦ на микросомальную ДЦ через цитохром b5.
28. Энергетический обмен играет ведущую роль в жизнедеятельности организмов, т. к. все функции организма энергозависимы. Систему механизмов, обеспечивающих стабильный уровень субстратов энергообмена называют энергетическим гомеостазом.
Одним из механизмов поддержания постоянного уровня АТФ в клетке, является наличие мегамитохондрий, которое дает большое преимущество.
Если один участок клетки плохо снабжается кислородом, то при помощи мегамитохондрий энергия Н+ транспортируется в этот участок и восполняет недостаток АТФ.
29. ЦТК, как и реакции митохондриального окисления, протекает в митохондриях. Представляет собой серию реакций, замкнутых в цикл. Образовавшиеся молекулы ЩУК реагируют с новой молекулой Ацетил-КоА и цикл повторяется вновь от образования цитрата до его превращения в ЩУК.
В реакциях этого цикла участвуют четыре из девяти субстратов МтО. Происходит серия дегидрогеназных реакций. Из них 3-я, 4-я и 8-я происходят с участием НАД-зависимых дегидрогеназ, и каждая из этих реакций позволяет получить 3 молекулы АТФ. На 6-й стадии происходит ФАД-зависимая дегидрогеназная реакция, которая сопряжена с образованием 2-х молекул АТФ (Р/О = 2).
На 5-й стадии 1 молекула АТФ образуется путем субстратного фосфорилирования.
Итого за 1 оборот ЦТК образуется 12 молекул АТФ.
Смысл ЦТК заключается в том, чтобы остатки уксусной кислоты расщепились с образованием большого количества АТФ. Кроме того, из ацетатных остатков образуется СО2 и Н2О, как конечные продукты обмена веществ.
СО2 образуется в ходе ЦТК дважды:
1. на третьей стадии (окисление изоцитрата)
2. на четвертой стадии (окисление альфа-кетоглутарата).
Если прибавить еще 1 молекулу СО2, которая образуется до начала ЦТК - при превращении ПВК в Ацетил-КоА, то можно говорить о трех молекулах СО2, образующихся при распаде ПВК. Суммарно эти молекулы, образующиеся при распаде ПВК, составляют до 90% углекислоты, которая выводится из организма.