М. В. Бадлеева Краткий курс лекций по микробиологии

монады, бифидобактерии, фузобактерии, актиномицеты, лактобактерии, стафилококки, стрептококки и др. Состав микрофлоры рта регулируется механическим действием слюны и языка. Пищевод практически не содержит микроорганизмы. В желудке находятся лактобациллы, дрожжи, единичные кокки и Грам(-) бактерии. Концентрация бактерий в желудке меньше из-за низкого значения рН. Желудок в норме – это своеобразная стерилизационная камера (за счет соляной кислоты, пепсиногена и др.). В тонкой кишке находится 105-108 м/о на 1 мл содержимого. Колонизируют бифидобактерии, клостридии, энтерококки, лактобактерии. В толстой кишке находится наибольшее количество микроорганизмов: в 1 г фекалий

– до 1012 микробных тел, около 95 % всех видов микроорганизмов – анаэробы. Здесь колонизируют: Грам(-) анаэробы: бифидобактерии, лактобациллы, эубактерии; Грам(+) спорообразующие анаэробные палочки: клостридии; энтерококки; Грам(-) анаэробные палочки: бактероиды; Грам(-) факультативно-анаэробные палочки: кишечная палочка, цитробактер, энтеробактер, клебсиеллы, протей и др.; анаэробные Грам(+) кокки: пептострептококки, пептококки. На эпителии успешно растут спирохеты.

В результате антагонистических свойств микроорганизмов и блокирующего действия секреторного IgA поддерживается относительно постоянный состав нормальной микрофлоры.

Микрофлора мочеполовой системы. Почки, мочеточники, моче-

вой пузырь, матка, простата в норме стерильны.

Микрофлора наружных гениталий: эпидермальные стафилокок-

ки, коринеформные бактерии, зеленящие стрептококки, сапрофитные микобактерии, энтеробактерии.

Микрофлора слизистой передней уретры у обоих полов: стафи-

лококки, коринеформные бактерии, сапрофитные трепонемы, непатогенные нейссерии и др.

Микрофлора влагалища в норме: бифидобактерии, лактобактерии, бактероиды, пропионибактерии, порфиромонады и др. Преобладают анаэробы.

Значение нормальной микрофлоры организма человека:

1.Несет функции неспецифической резистентности организма;

2.Обладает антагонистическими свойствами против патогенной

игнилостной микрофлоры, конкурирует с посторонней микрофлорой за счет высокого биологического потенциала;

41

3.Участвует в водно-солевом обмене, регуляции газового состава кишечника, обмене белков, углеводов, жирных кислот, холестерина, нуклеиновых кислот;

4.Участвует в продукции биологически активных соединений: антибиотиков, витаминов, токсинов и др.

5.Участвует в переваривании и детоксикации экзогенных субстратов и метаболитов из печени в кишечник и последующего возврата в нее;

6.Выполняет антимутагенную функцию, разрушая канцерогенные вещества в кишечнике;

7.Оказывает влияние на формирование и поддержание иммуни-

тета;

8.Важнейшей функцией нормальной микрофлоры является ее участие в колонизационной резистентности.

Колонизационная резистентность – это совокупность защитных факторов организма и свойств нормальной микрофлоры кишечника, придающих стабильность микрофлоре и предотвращающих колонизацию слизистых оболочек патогенными микроорганизмами. При ее снижении увеличивается количество и спектр аэробных условнопатогенных микроорганизмов, что ведет к развитию эндогенных гнойно-воспалительных процессов. Для поддержания определенного уровня колонизационной резистентности используют селективную деконтаминацию.

Селективная деконтаминация – это избирательное удаление из пищеварительного тракта аэробных бактерий и грибов для повышения сопротивляемости организма к инфекционным агентам. Назначают для приема внутрь малоадсорбируемые химиопрепараты, подавляющие аэробную часть и не влияющие на анаэробы, ванкомицин, гентамицин и нистатин.

Последствия дисбаланса нормальной микрофлоры. Нормальная микрофлора может стать источником эндогенной инфекции. При снижении иммунитета могут возникать различные нарушения: бактероиды, обитающие в норме в кишечнике, могут вызывать абсцессы при травмах или хирургических операциях. Эпидермальный стафилококк может колонизировать внутривенные катетеры, вызывая нарушения кровотока. E.coli поражает мочевую систему. Гистамин, высвобождающийся при действии микробных декарбоксилаз и липополисахарид, может вызвать аллергические состояния. Нормальная микрофлора – источник лекарственной устойчивости к ан-

42

тибиотикам. Санитарно-показательные микроорганизмы используют как критерий об их эпидемиологической опасности.

Дисбактериоз – состояние, развивающееся в результате утраты нормальных функций микрофлоры. Различают дисбактериоз и дисбиоз. При дисбактериозе изменяется количественный и качественный состав нормальной микрофлоры. При дисбиозе изменения происходят среди отдельных групп м/о (вирусы, грибы и др.). Дисбактериоз и дисбиоз приводят к эндогенным инфекциям. Причины нарушения динамического равновесия нормальной микрофлоры и организма человека:

влияние окружающей среды; стрессы;

широкое и бесконтрольное применение АБП, лучевой терапии и химиотерапии;

нерациональное питание;

оперативные вмешательства и т.д.

Классификация дисбиозов по этиологии: грибковый; стафило-

кокковый; протейный и др.

Классификация дисбактериозов по локализации: дисбактериоз рта; дисбактериоз кишечника; дисбактериоз влагалища и т.д. Изменения в составе и функциях нормальной микрофлоры сопровождаются различными нарушениями: развитием инфекций, диареи, гастрита, колита, язвенной болезни, аллергии и др.

Лабораторная диагностика дисбактериоза предусматривает выявление видового и количественного состава путем высева исследуемого материала на дифференциально-диагностические среды (ДДС), определение в исследуемом материале микробных метаболитов – маркеров дисбактериоза (жирных кислот, гидроксижирных кислот, жирнокислотных альдегидов, ферментов и т.д.).

Дифференциально-диагностические среды: Блаурокка – для би-

фидобактерий; среда МРС-2 – для лактобактерий; среда Левина или Эндо – для энтеробактерий; желчно-кровяной агар – для энтерококков; кровяной агар – для стрептококков и гемофилов; мясопептонный агар с фурагином – для синегнойной палочки; среда Сабуро – для грибов.

Для восстановления нормальной микрофлоры проводят селек-

тивную деконтаминацию; для лечения назначают эубиотики (бифидумбактерин, колибактерин, лактобактерин и др.), специальные бактериофаги.

43

Лекция 9

ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ

Особенности бактерий в генетическом аспекте

относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);

гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК (IS-последовательности, транспозоны, плазмиды);

половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;

легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Этапы эволюции генетической системы:

Кодон → ген → оперон → геном вирусов и плазмид → хромосо-

ма прокариот (нуклеоид) → хромосома эукариот (ядро).

Ген – это универсальная структурная единица живой материи, которая обеспечивает единство и многообразие всех форм существования жизни, ее непрерывность и эволюцию. Ген является единственным носителем и хранителем жизни, а его продукт – белок – определяет способ и форму существования.

Фундаментальные функции гена

1.Непрерывность наследственности. Обеспечивается механизмом репликации ДНК.

2.Управление структурами и функциями организма. Осуществляется с помощью единого генетического кода из 4-х оснований. Код триплетный, кодон – функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований.

3.Эволюция организмов. Обеспечивается благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

Геном – совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме или в наборе хромосом. Объем генома у различных микроорганизмов сильно варьирует. От объема генома зависит степень сложности структурной организации микробов.

Генотип – совокупность индивидуальных генов, состоящих из нуклеотидов ДНК.

44

Фенотип – совокупность реализованных генетических признаков микроорганизмов, т.е. индивидуальное проявление генотипа. При изменении условий существования фенотип изменяется при сохранении генотипа.

Особенности генетики бактерий:

хромосомы бактерий – нуклеоид – располагаются свободно в цитоплазме, не имеют мембран и связаны с рецепторами на ЦПМ (до 4-х тыс. отдельных генов);

содержание ДНК у микроорганизмов непостоянно. У всех других живых существ содержание ДНК постоянное, удваивается перед делением;

передача информации: от родительской клетки к дочерним с помощью механизмов: коньюгации, сексдукции, трансдукции, трансформации;

помимо хромосомы имеются дополнительные генетические структуры: IS-последовательности, транспозоны, плазмиды;

уникальное свойство бактерий: регулируя содержание копий своих геномов, бактерии одновременно приспосабливают скорость своего размножения к условиям роста.

Особенности репликации бактериальной ДНК. Три типа репликации ДНК:

вегетативная: передача генетической информации от родительской клетки дочерним, контролируется хромосомными или плазмидными генами;

коньюгативная: достройка нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора к реципиенту. Конролируется только плазмидными генами;

репаративная: устранение структурных повреждений из ДНК. Контролируется хромосомными или плазмидными генами.

Фенотипическая изменчивость – это способ приспособления микроорганизмов к условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться в изменяющихся условиях. Приобретенные свойства не передаются по наследству. Морфологическая модификация – изменение формы и величины бактерий; культуральная модификация – изменение культуральных свойств бактерий при изменении состава питательной среды; биохимическая

(ферментативная) модификация – нарушение синтеза ферментов.

45

Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и генетических рекомбинаций.

Мутации – это передаваемые по наследству структурные изменения генов, ведущие к фенотипическим изменениям бактерий.

Классифиция мутаций по протяженности: точечные мутации: повреждения ограничиваются одной парой нуклеотидов, могут полностью ревертировать; протяженные мутации или абберации –

выпадение или изменение относительно крупных участков генома, ревертации не подлежат.

Протяженные мутации или абберации в виде:

делеции – выпадение нескольких пар нуклеотидов; дупликации – добавление пар нуклеотидов; транслокации – перемещение фрагментов хромосомы; инверсии – перестановка нуклеотидных пар.

Причины мутаций: спонтанные – возникают самопроизвольно, без воздействия извне; индуцированные – под влиянием внешних факторов-мутагенов.

Точечные спонтанные мутации возникают в результате возникновения ошибок при репликации ДНК. Спонтанные хромосомные абберации возникают вследствие перемещения подвижных генетических элементов.

Генетическая рекомбинация – это взаимодействие между двумя ДНК, которое приводит к образованию рекомбинантной ДНК, формированию дочернего генома, сочетающего гены обоих родителей.

Виды генетических рекомбинаций: общая рекомбинация; сайт-

специфическая рекомбинация; рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК: комплементарное спаривание между 1-цепочечными участками, принадлежащими разным родительским ДНК. Процесс общей рекомбинации (расплетание нитей ДНК, комплементарное достраивание нитей, разрезание нитей по окончании процесса рекомбинации) контролируется генами, объединенных в REC-систему, состоящую из генов rec А, В, С.

Сайт-специфическая рекомбинация. Происходит в определен-

ных участках генома, не требует высокой степени гомологии ДНК и не зависит от генов recА, В, С.

Рекомбинации, контролируемые транспонируемыми элемента-

ми, являются сайт-специфическими, но специфичность этих сайтов

46

связана с особыми нуклеотидными последовательностями и не зависит от гена recА.

Передача генетической информации у бактерий:

Трансформация – перенос генетической информации, при котором бактерия-реципиент способна воспринимать ДНК другой клетки.

Трансдукция: неспецифическая и специфическая – перенос генетического материала от бактерии-донора бактерии-реципиенту с помощью бактериофага. Неспецифическая трансдукция – случайный перенос фрагментов ДНК от бактерии-донора бактерииреципиенту. Специфическая трансдукция – это передача фагом только некоторых специфических генов, локализованных на специальных участках бактериальной хромосомы.

Коньюгация – это передача генетического материала от одной бактерии к другой при непосредственном контакте клеток.

Генетические методы исследования: полимеразная цепная реак-

ция; рестрикционный анализ; метод молекулярной гибридизации. Полимеразная цепная реакция позволяет обнаружить возбуди-

тель в исследуемом материале по наличию в нем ДНК микроба без выделения чистой культуры.

Рестрикционный анализ – используются рестриктазы, расщепляющие молекулы ДНК (разрыв фосфатных связей в определенных последовательностях нуклеотидов). В геноме м/о есть строго определенное число участков узнавания для определенной рестриктазы. Если ДНК конкретного микроба обработать соответствующей рестриктазой, то образуется строго определенное количество фрагментов ДНК фиксированного размера. Результат исследования узнают с помощью электрофореза в агарозном геле.

Метод молекулярной гибридизации позволяет выявить степень сходства различных ДНК – для идентификации м/о. Метод основан на отжиге ДНК: денатурация ДНК в щелочной среде при 90 С → понижение t до 10 С → восстановление исходной структуры ДНК. Необходимо наличие молекулярного зонда.

Плазмиды – внехромосомный генетический материал (ДНК) – просто устроены, наделяют бактерии дополнительными полезными свойствами. Лишены оболочек, а также собственных систем синтеза белка и мобилизации энергии. Имеют собственные гены, обладают специфическими наследственными признаками, способностью к размножению. По молекулярной массе плазмиды значительно

47

меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50-ти генов. Все известные плазмиды представляют собой кольцевидные суперспирализованные молекулы 2-нитевой ДНК. Размеры: 1,5-200 МД. Сходны с вирусами, но отличаются по некоторым признакам.

Свойства плазмид:

Саморегулируемая репликация.

Явление поверхностного исключения. Под контролем плазмид синтезируются белки клеточной стенки, исключающие проникновение родственной плазмиды.

Явление несовместимости. Суть: две родственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из плазмид удаляется.

Контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки. Плазмиды имеют собственную систему регуляции репликации ДНК.

Контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине.

Контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки.

Основные категории плазмид:

F-плазмиды выполняют донорские функции, индуцируют деление (от fertility – плодовитость). Интегрированные F-плазмиды: Hfr-плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

R-плазмиды (resistance) обеспечивают устойчивость к лекарственным препаратам.

Col-плазмиды осущестляют синтез колицинов – факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм).

Hly-плазмиды производят синтез гемолизинов. Ent-плазмиды осуществляют синтез энтеротоксинов. Tox-плазмиды выполняют токсинообразование.

Распространение плазмид. Существует два способа распространения:

Передача плазмид от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления;

Перенос между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления.

Медицинское значение плазмид:

Контроль различных факторов патогенности у многих видов бактерий (возбудители чумы, сибирской язвы, дизентерии и т.д.).

48

Формирование новых эпидемических клонов патогенных бактерий – носителей R-плазмид.

Контроль генетического обмена у бактерий.

Создание условий для размножения патогенных бактерий в естественных условиях, контролируя синтез факторов патогенности.

Плазмиды – уникальное средство самозащиты бактерий, т.к. они обеспечивают приобретенным и наследуемым специфическим иммунитетом против различных факторов воздействия.

Лекция 10

МЕДИЦИНСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

Медицинская биотехнология – наука, которая на основе изучения процессов жизнедеятельности микроорганизмов, использует эти биопроцессы, а также сами биообъекты для промышленного производства продуктов, необходимых для жизни человека. Биотехнология возникла и оформилась на стыке микробиологии, молекулярной биологии, генетической инженерии, иммунологии и других наук.

Цель биотехнологии: получение продуктов из биообъектов или с их применением, а также воспроизведение биоэффектов, не встречающихся в природе.

История развития биотехнологии:

Эмпирический этап биотехнологии (около 6000–5000 лет до н. э.): люди научились выпекать хлеб, варить пиво, приготовлять сыр и вино.

Второй, научный этап биотехнологии (открытие Л. Пастером в XIX в. ферментативной природы брожения): получены и выделены ферменты; открыты многие м/о; разработаны способы их выращивания: получены культуры животных и растительных клеток, и разработаны способы искусственного культивирования;

Новая биотехнология основана на достижениях молекулярной биологии и микробиологии, генетики и генной инженерии, иммунологии и химической технологии (искусственно полученные

49

штаммы). Сердцевиной ее явилась генетическая инженерия, индустрия рекомбинантных ДНК.

Одной из важных задач генной инженерии и биотехнологии в наши дни является расшифрование генома человека. Создана программа «Геном человека». Основная цель этой программы — прочтение наследственной информации для исправления наследственных повреждений генома человека. На сегодня расшифровано около 5 тыс. из 40-50 тыс. генов ДНК человека, а также расшифрована нуклеотидная последовательность всей ДНК человека.

Направления биотехнологии. В настоящее время выделяют 4

приоритетных направления: медико-фармацевтическое; продовольственное; сельскохозяйственное; экологическое.

Промышленное производство в биотехнологии. Основано на нескольких принципах:

брожении (ферментация); биоконверсии (превращение одного вещества в другое);

культивировании растительных и животных клеток, бактерий и вирусов;

на генетических манипуляциях (генно-инженерные процедуры).

Значение биотехнологии:

оздоровление окружающей среды; создание трансгенных животных и растений;

получение уникальных биотехнологических эффектов в целях диагностики, профилактики и лечения врожденных болезней, влияния на свойства генома человека, животных и растений.

Биосенсоры – продукт биотехнологии. Используются для опре-

деления, индикации и идентификации БАВ и макромолекул. Принцип работы биосенсоров: регистрация с помощью датчиков и детекторов физических, химических или биологических эффектов, возникающих при взаимодействии детектируемых клеток и молекул с биореагентами. Биологические объекты – одноклеточные м/о, животные и растительные клетки, организм животных, человека или растений.

Причины выбора биообъектов. Клетки – биофабрики: вырабаты-

вают ценные продукты: белки, жиры, углеводы, витамины и т.д.

50