М. В. Бадлеева Краткий курс лекций по микробиологии

дуцента и «бессмертием» трансформированной раковой клетки – клетки-гибридомы. Гибридома хорошо размножается и в неограниченном количестве вырабатывает антитела. Гибридомные моноклональные антитела применяют при создании диагностических и лечебных иммунобиологических препаратов.

Полные и неполные антитела. Деление основано на способности образовывать в РА или преципитации хорошо различимую глазом макромолекулярную структуру гигантского иммунного комплекса –

полные антитела (IgМ, IgА и IgС). Неполные антитела лишены такой способности – непреципитирующие или блокирующие антитела. Причиной может быть экранирование одного из антигенсвязывающих центров Ig, а также недостаточное число или малая доступность антигенных детерминант на молекуле антигена.

Свойства антител. Образование устойчивых иммунных комплексов: могут оказывать прямое или опосредованное воздействие на антигены: нейтрализовать, маркировать антигены, вызывать его деструкцию или элиминацию.

Прямой эффект антител: нейтрализация: связывание и блокирование паратопом Ig активного центра токсина, рецептора, лекарства и пр. На этом принципе основан механизм действия антитоксических, противовирусных и других лечебных иммунных сывороток.

Непрямой эффект: активация комплемента по классическому пути и индукция комплемент-опосредованного лизиса чужеродных клеток, запуск антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, опосредование гиперчувствительности немедленного типа, или I типа, индукция иммунного фагоцитоза, что способствует элиминации антигена из организма.

Антителообразование зависит от дозы, кратности введения антигена, способа введения антигена.

Различают две фазы первичного иммунного ответа на антиген: индуктивная и продуктивная. Индуктивная – от момента введения антигена до появления антителообразующих клеток (12-20 ч); продуктивная – начинается к концу 1-х суток после введения антигена и характеризуется появлением антител в сыворотке крови. Количество антител постепенно увеличивается (к 4-му дню), достигая максимума на 7-10-й день, уменьшается к концу 1-го месяца.

Вторичный иммунный ответ развивается при повторном введении антигена. Индуктивная фаза намного короче – антитела вырабатываются быстрее и интенсивнее.

81

Иммунологическая память. В основе иммунологической памяти лежит феномен вторичного иммунного ответа. Иммунологическая память имеет высокую специфичность к конкретному антителу. Она распространяется на гуморальное и клеточное звено иммунитета, обусловлена В- и Т-л и сохраняется годами. Существует 2 механизма формирования иммунологической памяти:

длительное сохранение антигена в организме (персистирующие возбудители инфекций) поддерживает в напряжении иммунную систему;

наличие клеток иммунологической памяти – малые покоящиеся клетки, дифференцирующие из Т- и В-лимфоцитов.

Положительные стороны иммунологической памяти: при вакцинации населения создается напряженный иммунитет, который поддерживается длительное время.

Отрицательные стороны иммунологической памяти: криз отторжения – повторная попытка трансплантировать уже однажды отторгнутую ткань вызывает быструю и бурную реакцию.

Иммунологическая толерантность – явление, противоположное иммунному ответу и иммунологической памяти. Проявляется отсутствием специфического продуктивного иммунного ответа организма на антиген из-за неспособности его распознавания. Иммунологическую толерантность вызывают антигены–толерогены. Характерна специфичность – она направлена к строго определенным антигенам. Степень проявления иммунологической толерантности зависит от возраста и состояния иммунореактивности организма. Причины развития иммунологической толерантности:

Элиминация из организма антиген-специфических клонов лимфоцитов. Элиминации подвергаются клоны аутореактивных Т- и В-лимфоцитов на ранних стадиях онтогенеза. Активация антигенспецифического рецептора незрелого лимфоцита индуцирует в нем апоптоз.

Блокада биологической активности иммунокомпетентных клеток: цитокины, воздействуя на рецепторы, способны вызвать ряд «негативных» эффектов – пролиферацию Т- и В-л, активное торможение β-трансформирующего фактора роста.

Быстрая нейтрализация антигена антителами.

Исторически иммунологическую толерантность рассматривают как защиту против аутоиммунных заболеваний. При нарушении толерантности к собственным антигенам могут развиваться ауто-

82

иммунные реакции или аутоиммунные заболевания, такие как ревматоидный артрит, системная красная волчанка и другие.

Основные механизмы отмены толерантности и развития аутоиммунных реакций:

1.Изменения химической структуры аутоантигенов (например, изменение нормальной структуры антигенов клеточных мембран при вирусных инфекциях, появление ожоговых антигенов).

2.Отмена толерантности на перекрестно-реагирующие антигены микроорганизмов и эпитопы аутоантигена.

3.Появление новых антигенных детерминант в результате связывания чужеродных антигенных детерминант с клетками хозяина.

4.Нарушение гисто-гематических барьеров.

5.Действие суперантигенов.

6.Нарушения регуляции иммунной системы (уменьшение количества или функциональная недостаточность супрессирующих лимфоцитов, экспрессия молекул МНС II класса на клетках, в норме их не экспрессирующих – тиреоциты при аутоиммунном тиреоидите).

Феномен иммунологической толерантности используется при пересадке органов и тканей, подавлении аутоиммунных реакций, лечении аллергии и других патологий, связанных с агрессивным поведением иммунной системы.

Роль антител в формировании иммунитета. Антитела имеют важное значение в формировании приобретенного постинфекцион-

ного и поствакцинального иммунитета.

1.Связываясь с токсинами, антитела нейтрализуют их, обеспе-

чивая антитоксический иммунитет.

2.Блокируя рецепторы вирусов, антитела препятствуют адсорбции вирусов на клетках, участвуют в противовирусном иммунитете.

3.Комплекс «антиген-антитело» запускает классический путь активации комплемента с его эффекторными функциями (лизис бактерий, опсонизация, воспаление, стимуляция макрофагов).

4.Антитела принимают участие в опсонизации бактерий, способствуя более эффективному фагоцитозу.

5.Антитела способствуют выведению из организма (с мочой, желчью) растворимых антигенов в виде циркулирующих иммунных комплексов.

IgG принадлежит наибольшая роль в антитоксическом иммунитете, IgM – в антимикробном иммунитете (фагоцитоз корпускулярных антигенов), особенно в отношении грам(-)бактерий, IgA – в

83

противовирусном иммунитете (нейтрализация вирусов), IgA – в местном иммунитете слизистых оболочек, IgE – в реакциях гиперчувствительности немедленного типа.

Лекция 17

КЛЕТОЧНЫЙ И ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ

Опосредованный клетками киллинг осуществляют активированные фагоциты; Т-киллеры; естественные киллеры и некоторые другие клетки.

Клетки-киллеры уничтожают чужеродные, трансформированные или инфицированные клетки.

Механизм клеточно-опосредованного киллинга. Киллеры выра-

батывают вещества с цитотоксическим или цитолитическим действием, вызывают некроз клеточной стенки или индуцируют апоптоз. Цитотоксические субстанции синтезируются только при активации клетки. Киллеры осуществляют свою функцию дистантно (на расстоянии) или при непосредственном контакте. Мишенью являются раковые, мутантные, зараженные вирусами клетки, грибы, простейшие, гельминты и некоторые бактерии. Способ распознавания киллерами клеток-мишеней зависит от их антиген-связывающего рецептора. Различают антителозависимую и антителонезависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность.

Антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность осуществляют макрофаги, естественные киллеры и эозино-

филы. Активированные макрофаги продуцируют перекисные и N0- ион-радикалы и ферменты, поражают стенку клетки-мишени на расстоянии или после фагоцитирования. Естественный киллер при контакте с зараженной клеткой индуцирует разрушение клетокмишеней осмотическим лизисом (перфорин) или индукцией в них апоптоза (гранзимы, гранулизин). Эозинофилы имеют узкую противогельминтную ориентацию. При распознавании паразитов, «отмеченных» IgА или IgЕ, эозинофилы выделяют путем дегрануляции антигельминтные токсические факторы (ферменты и белковые токсины). Далее они синтезируют цитокины, стимулирующие клеточное звено иммунитета, липидные медиаторы воспаления.

84

Антителонезависимая клеточно-опосредованная цитотоксич-

ность. Непосредственно Ig не участвуют. Индукторами являются клетки лимфоидного ряда: Т-х, Т-к и NK-клетки. Выделяют прямой и непрямой механизмы. Прямой механизм цитотоксичности: Т-к распознает антиген в составе МНС I класса на ЦПМ клеток собственного организма и запускает цитотоксические механизмы: осмотический лизис (перфорин) и апоптоз (гранзимы, гранулизин). Непрямой механизм цитотоксичности: только Т-х распознают антиген в составе МНС II класса. Сами не запускают цитотоксические механизмы: Т1-х активирует макрофаг, Т2-х – эозинофил, включая их цитотоксические свойства.

Аллергические заболевания широко распространены, что связано с рядом факторов – ухудшением экологической обстановки и широким распространением аллергенов, усилением антигенного давления на организм (в том числе вакцинация), искусственным вскармливанием, наследственной предрасположенностью.

Аллергия (от лат. allos + ergon – другое действие) – состояние патологически повышенной чувствительности организма к по-

вторному введению антигена. Антигены, вызывающие аллергические состояния, называют аллергенами. Аллергическими свойствами обладают различные чужеродные растительные и животные белки, а также гаптены в комплексе с белковым носителем.

Аллергические реакции – иммунопатологические реакции, связанные с высокой активностью клеточных и гуморальных факторов иммунной системы (иммунологической гиперреактивностью). Иммунные механизмы, обеспечивающие защиту организма, могут приводить к повреждению тканей, реализуясь в виде реакций гиперчувствительности.

История изучения аллергии. Первая классификация аллергии была предложена Р. Куком в 1947 г. В ее основу было положено время развития аллергической реакции. ГНТ была описана франццузскими учеными Ш. Рише и Ж. Портье и русским ученым Г.П. Сахаровым (1902-1905 гг.). Явление ГЗТ было установлено Р. Кохом (1890). Джеллом и Кумбсом создана новая классификация на основе изучения молекулярных механизмов аллергий (1968 г.).

Стадии аллергической реакции. Иммунологическая: в ответ на аллерген образуются антигенчувствительные клетки, специфические антитела и иммунные комплексы; патохимическая: образуются медиаторы воспаления и БАВ, которые играют основную роль в

85

механизме аллергических реакций; патофизиологическая: проявляется клиническая картина аллергической реакции.

Выделяют четыре типа аллергических реакций: анафилактиче-

ский (I тип); цитотоксический (II тип); иммунокомплексный (III тип); опосредованный клетками (IV тип).

Анафилактическая реакция I типа: реагины (IgE и G4) обладают цитофильностью к тучным клеткам и базофилам. Образующийся рецепторный комплекс, связываясь с аллергеном, вызывает дегрануляцию базофила и тучной клетки. Происходит залповый выброс БАВ (гистамин, гепарин и др.) в межклеточное пространство. Действие БАВ мгновенно, но кратковременно вызывает сокращение гладкой мускулатуры кишечника, бронхов, мочевого пузыря; активацию секреторных, эндотелиальных и других клеток. Результат: бронхоспазм, вазодилитация, отек и прочие симптомы, характерные для анафилаксии.

Цитотоксический тип аллергии. IgМ и IgG связываются с кле-

точными мембранами клеток-мишеней и запускают различные механизмы антителозависимой цитотоксичности. Классический пример массивного цитолиза: гемолитическая болезнь (резус-конфликт, переливание иногруппной крови). Эритроциты резус+ (RhD+) плода попадают в кровь матери во время родов, что стимулирует образование антител анти-Rh класса IgG в послеродовой период. При последующих беременностях IgG-антитела проходят через плаценту в кровь плода (IgM через плаценту не проникают). Если плод опять оказывается RhD+, IgG-а/т матери вызывают разрушение эритроцитов плода. У ребенка, страдающего ГБН, отмечается увеличение размеров печени и селезенки из-за разрушения эритроцитов, вызванного материнскими антителами. В крови ребенка повышена концентрация билирубина (продукта распада Нв). Геморрагические петехии на лице указывают на нарушение функции тромбоцитов.

Иммунокомплексный тип – III тип аллергических реакций. Фагоцитирующие клетки не могут быстро утилизировать большое количество циркулирующих иммунных комплексов. В качестве клинического примера можно привести осложнения от применения иммунных сывороток с лечебно-профилактической целью (сывороточная болезнь), при вдыхании белковой пыли («легкое фермера»).

Клеточно-опосредованный тип – IV тип реакции (ГЗТ), лимфо-

идно-макрофагальная реакция – развивается в результате иммунной активации макрофагов под влиянием лимфоцитов, сенсибилизиро-

86

ванных к аллергену. Основа ГЗТ – нормальные механизмы иммунного воспаления.

Т-клетки ГЗТ распознают чужеродные антигены и секретируют гаммаинтерферон и различные лимфокины, стимулируя цитотоксичность макрофагов, усиливая Т- и В-иммунный ответ, вызывая воспалительный процесс.

Исторически ГЗТ выявлялась в кожных аллергических пробах (с туберкулином – туберкулиновая проба), выявляемых через 24-48 ч после внутрикожного введения антигена. Развитием ГЗТ на вводимый антиген отвечают только организмы с предшествующей сенсибилизацией этим антигеном.

Классический пример инфекционной ГЗТ – образование инфекционной гранулемы (при бруцеллезе, туберкулезе, брюшном тифе и др.). Гистологически ГЗТ характеризуется инфильтрацией очага вначале нейтрофилами, затем лимфоцитами и макрофагами. Сенсибилизированные Т-клетки ГЗТ распознают гомологичные эпитопы, представленные на мембране дендритных клеток, а также секретируют медиаторы, активирующие макрофаги и привлекающие в очаг другие клетки воспаления. Активированные макрофаги и другие участвующие в ГЗТ клетки выделяют ряд биологически активных веществ, вызывающих воспаление и уничтожающих бактерии, опухолевые и другие чужеродные клетки – цитокины (ИЛ-1, ИЛ-6, альфа-фактор некроза опухолей), активные метаболиты кислорода, протеазы, лизоцим и лактоферрин.

Особенности противовирусного иммунитета. Обусловлен 2-мя формами существования вируса: внеклеточная и внутриклеточная. Антитела взаимодействуют только с внеклеточным вирусом: нейтрализуют их, препятствуя адсорбции на клетке-мишени, инфицированию и генерализации процесса. Они также связывают вирусные белки и нуклеиновые кислоты, попадающие в межклеточное пространство после разрушения зараженных вирусами клеток. Образовавшиеся иммунные комплексы подвергаются фагоцитозу.

При внутриклеточной форме существования вируса сигналом для активации Т-к является экспрессия вирусных белков на ЦПМ клетки-хозяина в составе молекул антител гистосовместимости. Т- киллеры распознают зараженные вирусом клетки и уничтожают их.

Дополнительные особенности противовирусного иммунитета:

интерферон обладает мощным противовирусным действием. Он связывается с рецептором на мембране клетки-хозяина и индуциру-

87

ет ферментные системы, подавляющие в ней все биопроцессы. Сывороточные ингибиторы неспецифически связываются с вирусной частицей и нейтрализуют ее, препятствуя адгезии вируса на клет- ках-мишенях. Напряженность противовирусного иммунитета оценивают по нарастанию титра специфических антител в парных сыворотках в процессе болезни.

Особенности противоопухолевого иммунитета. В организме при нарушении нормальных физиологических процессов могут появляться мутантные и опухолевые клетки. Мутантные клетки имеют измененные а/г гистосовместимости. Поэтому они активируют гуморальное и клеточное звенья иммунитета. Низкая иммуногенность свойственна для раковых клеток. Эти клетки практически не отличаются от нормальных. Слабому иммунологическому распознаванию опухолевых клеток способствует отсутствие воспалительной реакции в месте онкогенеза, экранирование раковых клеток противоопухолевыми антителами. Механизм иммунитета слабо изучен. Основная роль: активированные макрофаги, естественные киллеры. Защитная функция гуморального иммунитета спорная: антитела могут экранировать антигены опухолевых клеток, не вызывая их цитолиза.

Особенности трансплантационного иммунитета. Реакция от-

торжения не возникает в случае полной совместимости донора и реципиента по а/г гистосовместимости. Выраженность реакции отторжения зависит от степени чужеродности, объема трансплантируемого материала и состояния иммунореактивности реципиента.

Лекция 18

ИММУННОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ

Иммунные реакции используют при диагностических и иммунологических исследованиях у больных и здоровых людей. Серологические методы – методы изучения взаимодействия между антигеном и антителом. Их используют для выявления антител в сыворотке больного, т.е. для серодиагностики, определения вида или типа антигена – идентификации выделенного от больного микроорганизма.

88

Реакция агглютинации (РА) – это склеивание и выпадение в осадок микробов или других клеток под действием антител в присутствии электролита.

Для реакции необходимы антитела (находятся в сыворотке больного или в иммунной сыворотке), антиген (взвесь живых или убитых микроорганизмов, эритроцитов или других клеток) и изотонический раствор. РА используют для определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) и др., определения возбудителя, выделенного от больного, определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)

основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами. Взаимодействие адсорбированных антигенов или антител с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. При отрицательной реакции эритроциты оседают в виде «пуговки». Широко применяют при диагностике ряда инфекций.

Реакция обратной непрямой гемагглютинации основана на при-

менении антительных эритроцитарных диагностикумов, на которых адсорбированы антитела. В практике применяются при диагностике инфекционных болезней, определении гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, выявлении повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении антигенов вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. Используют для диагностики вирусных инфекций: гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител

(непрямая реакция Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые специфически взаимодействуют с резусположительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Суть реакции: в систему антирезусные антитела + резусположительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыво-

89

ротку, что вызывает агглютинацию эритроцитов. Применяют для диагностики гемолитической болезни новорожденных.

Реакция препицитации (РП). РП – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Широкое применение получили разновидности реакции преципитации в полужидком геле агара.

Реакцию кольцепреципитации проводят в узких пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата. Практически применяют для диагностики ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине – для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарногигиенических исследованиях при установлении фальсификации продуктов; для определения филогенетического родства животных и растений.

Реакция связывания комплемента (РСК). Специфический ком-

плекс антиген-антитело адсорбирует на себе (связывает) комплемент. РСК проводят в 2 фазы: инкубация смеси, содержащей три компонента (а/г + а/т + комплемент); индикаторная: выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. Применяют для идентификации антигенов и серодиагностике инфекций, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

Реакция иммунного лизиса – это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Реакцию проводят в лунках геля из агара, содержащего эритроциты барана и комплемент. Вокруг гемолитической сыворотки, содержащей антитела против эритроцитов барана в результате радиальной диффузии антител образуется зона гемолиза. Применяют для диагностики вирусных инфекций: гриппа, краснухи, клещевого энцефалита.

Реакция нейтрализации. Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие микробов или токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микробных антигенов антителами.

Опсонофагоцитарная реакция (ОФР) – один из методов оценки активности иммунного фагоцитоза. Чем выше эта активность, тем

90