3.4 Введение пептида Аβ – модель ба.

Мы обнаружили, что в присутствии амилоидогенного пептида кальпаиновая система в гиппокампе и коре больших полушарий активировалась почти в 2 раза (рис. 1). При этом наблюдалось увеличение активности мембраносвязанной фракции кальпаинов до 16% от общего пула. Выраженная активация полноразмерных кальпаинов, особенно m-кальпаина, и их аутокаталитических фрагментов у животных с экспериментальной БА (зимограмма; рис. 1) является наиболее достоверным свидетельством активации кальпаиновой системы in vivo. Избирательную активацию этой формы кальпаинов, которой требуется нефизиологично высокая концентрация Са²⁺ для активации и аутолиза, мы наблюдаем на зимограммах у животных с выраженной НД (рис. 1, группа животных 3). Характерно, что в целом невысокая активность μ-кальпаина в нервной ткани, составляющая в норме менее 10% от уровня активности m-кальпаина, почти полностью утрачивалась у крыс с амилоидной нейродегенерацией (рис. 1, группа животных 3), что указывает на селективную регуляцию разных форм кальпаина при развитии патологии.

С помощью вестерн-блот-анализа было установлено, что в патологически измененных областях мозга крыс после применения β-амилоидного пептида уровень кальпастатина снизился до 47% от контрольного значения. Кроме того, кальпастатин в мозге животных с экспериментальной БА в значительной мере был фрагментирован (преобладал его 17 кДа-фрагмент) [32], при этом его гидролиз является кальпаинзависимым процессом [9]. Таким образом, повышение активности кальпаинов у экспериментальных животных повлекло за собой избыточную деградацию и истощение пула функционально активного кальпастатина (одновременно субстрата и ингибитора кальпаинов) и, в свою очередь, привело к повышению соотношения протеиназа – ингибитор и утрате контроля над кальпаинзависимым протеолизом.

Полученные результаты согласуются с рядом наблюдений. У больных деменцией альцгеймеровского типа во всех специфично поражаемых болезнью зонах мозга была описана аномальная активация преимущественно m-кальпаина и двукратное снижение уровня эндогенного ингибитора, кальпастатина [4, 33]. Локальный трехкратный прирост аутолизованной формы μ-кальпаина отмечался в структурах мозга, непосредственно не связанных с прогрессией БА – базальных ядрах и мозжечке [33], что подчеркивает генерализованный характер повреждения. Активация кальпаинов на фоне дефицита кальпастатина также была выявлена в мозге трансгенных мышей Tg2576, несущих мутантный вариант гена АРР человека [34]. Гиперактивация кальпаинов, наряду с дизрегуляцией других Са²⁺-зависимых регуляторных процессов, может способствовать повреждению и гибели клеток мозга при БА.

3.5 Введение глутамата – модель эксайтотоксичности.

Однократное введение токсической дозы экзогенного глутамата имитирует повреждения, типичные для острых патологий мозга – травмы, ишемии, инсульта. Однако для большинства медленно развивающихся НДЗ и физиологического старения характерен хронический избыток этого медиатора [24, 35]. Индуцированная в эксперименте глутаматная токсичность, в отличие от амилоидной, привела к снижению протеолитической активности кальпаинов (до 30%; рис. 2), при этом тормозился процесс их аутокаталитической активации и активность полноразмерной и аутолизованной форм. Уровень ферментов и их внутриклеточного ингибитора, кальпастатина (таблица 2), при этом достоверно не изменялся, что свидетельствует о регуляторных воздействиях на более высоких уровнях, по всей видимости, о снижении уровня внутриклеточного кальция.

Номер группы	Группа крыс	уровень кальпастатина, %
		серия эксперимента, агент
		I	II	III
1	интактные	100	100	100
2	ложнооперированные	91, NaCl	95, NaCl	84, NaCl
3	подвергнутые воздействию нейротоксичного агента	47, Аβ1-40	114, глутамат	106, глутамат
4	подвергнутые воздействию нейротоксичного агента на фоне потенциального нейропротектора	86, Аβ1-40 + 17β-эстрадиол	108, глутамат + 17β-эстрадиол	112, глутамат + нифедипин

Таблица 2. Уровень кальпастатина в мозге крыс при экспериментальных воздействиях*

*Приводится содержание ингибитора относительно его уровня у интактных животных, принятого за 100%

Данные результаты, в первом приближении, противоречат общепризнанным представлениям [13] о том, что нейропатология является следствием избыточной (в силу прироста внутриклеточного кальция) кальпаинзависимой белковой деградации. Однако в последнее десятилетие все больше доказательств находит гипотеза о том, что кальциевый ответ на повреждение ткани имеет фазовый характер, и вышеописанный механизм развития кальцийзависимой кальпаинопосредованной нейродегенерации – вторичное явление, а на ранних этапах нейропатологии имеет место дефицит кальциевой сигнализации и кальцийрегулируемых процессов, включая функциональную активность кальпаинов [36]. По-видимому, этот этап кратковременен и протекает в отсутствие видимых признаков заболевания, и, вполне вероятно, в эксперименте по однократному введению токсичной дозы глутамата мы смогли продемонстрировать именно эту фазу биохимических изменений в клетках. Отдаленные последствия хронического избытка глутамата можно было бы проследить, индуцируя персистентную глутаматную токсичность, например, при помощи интрацеребрального микродиализа.