3.6 Эстрогенная терапия индуцированной нд

Нейропротективный эффект половых стероидов отмечен давно и подтвержден на нескольких моделях нейродегенеративных заболеваний и нейротравм [32, 37, 38]. Показано плейотропное действие 17β-эстрадиола, замедляющего возрастные и патологические изменения в мозге по многим механизмам, включая снижение входа Са²⁺ в клетку и модуляцию синтеза кальпаинов [32, 39]. При введении эстрадиола на фоне амилоидой токсичности когнитивные способности животных были снижены в меньшей степени, а на фоне глутаматной токсичности поведенческие различия между группами животных 1, 2 и 4 отсутствовали. В данных исследованиях было показано, что терапия 17β-эстрадиолом в значительной степени отменяет биохимические нарушения, вызванные нейротоксичными агентами – пептидом Аβ (рис. 1) и глутаматом (таблица). Так, в тканях мозга животных 4-й группы из разных серий эксперимента активность кальпаинов, как общая, так и отдельных молекулярных форм, эффективно приближалась к показателям у контрольных животных, нормализовалось соотношение цитоплазматической и мембраносвязанной фракций кальпаинов (9–6 : 1, что приближается к исходным величинам; рис. 1 и 2). При этом меньшая доля предшественника m-кальпаина подвергалась аутолизу, а, следовательно, активации (рис. 1). Обработка эстрадиолом приводила к восстановлению нормального уровня активности μ-кальпаина, утраченной при введении β-амилоидного пептида (рис. 1). Кроме того, у крыс, получавших эстрогенную терапию, было менее заметно истощение тотального пула кальпастатина (до 86% от исходного в сравнении с 2-кратным снижением при действии амилоида; таблица), а его пул включал большее количество полноразмерного белка и меньше фрагментов.

Во многих исследованиях показано, что эстроген и его рецепторы способствуют выживанию нейронов в условиях Ca²⁺-опосредованной токсичности [39, 40]. Нейропротективный эффект 17β-эстрадиола, по крайней мере, частично, объясняется селективной эстрогензависимой регуляцией синтеза кальпаинов [41], направленной на снижение количества последних, что, в свою очередь, ведет к повышению толерантности к Ca²⁺. С использованием клеток нейробластомы человека SK-N-MC было показано, что в присутствии эстрогена и его рецептора субтипа ERα подавляется экспрессия μ- и m-кальпаинов, тогда как экспрессия кальпастатина не изменяется [42].

3.7 Введение нифедипина – блокатора Са²⁺-каналов – при индуцированной НД.

Поскольку нарушение динамического равновесия внутриклеточного Са²⁺ наблюдается при развитии большинства нейропатологий, острых и хронических, а также при нормальном старении [15], в эксперименте был протестирован нифедипин, блокатор потенциалуправляемых Са²⁺-каналов L-типа, на предмет возможного нейропротективного эффекта. Учитывая, что выбранная модель нейроповреждения сопровождалась снижением общей активности кальпаинов, введение нифедипина усилило этот эффект, особенно в отношении мембраносвязанной фракции ферментов (рис. 2). Отмеченный регуляторный эффект снижения уровня Са²⁺ отразился на степени аутолиза m-кальпаина и привел к преобладанию полноразмерной формы фермента в этих условиях (рис. 2, зимограмма). Поскольку активация кальпаинов происходит не диффузно по всему объему клетки, а локально, в области Са²⁺-каналов плазмалеммы [43], за счет селективного снижения притока кальция по определенным путям можно целевым образом воздействовать на “патологическую” форму кальпаинов – m-кальпаин, который активируется именно в примембранной области клетки и оказывает наиболее выраженный деструктивный эффект. Кроме того, при действии глутамата и его сочетания с нифедипином в нервной ткани крыс был отмечен более высокий уровень кальпастатина (табл.) и преобладание его высокомолекулярных форм; вероятное объяснение этого факта – сниженная активность кальпастатиндеградирующих ферментов – кальпаинов. Вероятно, эффект гиперактивации кальпаиновой системы, который развился бы при более длительном эксайтотоксическом действии глутамата, мог быть частично купирован введением исследованного блокатора Са²⁺-каналов. При сравнении ряда ингибиторов Ca²⁺-каналов было показано [39], что эффективность регулируемого нифедипином снижения притока Са²⁺ в клетку и сопутствующего цитопротективного действия сопоставима с эффективностью действия эстрогенов. С одной стороны, это свидетельствует о том, что механизм действия эстрогенов на кальциевый обмен реализуется путем регуляции именно этого типа Са²⁺-каналов, а с другой – о возможности альтернативного подхода к регуляции Са²⁺-каналов L-типа веществами естественного происхождения (эстрогенами), не уступающего по эффективности и специфичности фармакологическим препаратам.

ВЫВОДЫ

В ходе выполнения дипломной работы выполнен ряд учебно-научных задач.

Проведен анализ литературных источников по исследуемой проблеме.

Освоены некоторые методические приемы выделения, определения активности, идентификации основных молекулярных форм кальций-активируемых протеиназ, количественной оценки их ингибитора кальпастатина в тканях млекопитающих (на примере крыс).

В эксперименте по моделированию болезни Альцгеймера у лабораторных животных (крыс) обнаружены изменения кальпаин / кальпастатиновой системы, направленные на повышение каталитической активности Са²⁺-зависимых протеиназ и тесно связанные с дисбалансом внутриклеточного Са²⁺. В связи с этим, результаты изучения предложенной модели нейродегенерации можно экстраполировать на широкий круг родственных нарушений.

Показано, что в тканях мозга (коре больших полушарий, гиппокампе) крыс присутствуют основные, типичные для большинства тканей млекопитающих внутриклеточные протеиназы кальпаины, при этом можно выделить особенности в профиле их экспрессии, энзиматической активности и соотношении молекулярных форм, характерные для различных тканей (тканеспецифичность), а также для здоровых и патологически измененных тканей. Наиболее подробные данные получены для кальций-активируемых протеиназ (кальпаинов), поскольку их роль в развитии нейродегенерации, как возрастной, так и патологической, несомненна, но детально к настоящему времени не изучена.

Анализ биохимических изменений в мозге животных с амилоид-индуцированной нейродегенерацией показал, что ведущую роль в развитии тканевой патологии (избыточной гибели нервных клеток по механизмам апоптоза и некроза) играет дизрегуляция кальпаиновой системы. Нарушения в работе указанной протеолитической системы вызваны, во-первых, снижением содержания в тканях их естественного ингибитора, кальпастатина, то есть нарушением баланса протеиназа / ингибитор, а, во-вторых, нарушением баланса внутриклеточного Са2+, сопровождающим развитие дегенеративных изменений во многих тканях, в том числе, нервной. В модельном эксперименте получены данные, подтверждающие возможность модулирования процесса нейродегенерации за счет введения половых стероидов (эстрадиола), обладающих, наряду с ранее показанным антиоксидантным и антиапоптотическим действием, способностью к избирательной регуляции Са2+-зависимых протеиназ в тканях.

Полученные данные отличаются новизной, дополняют имеющиеся в литературе сведения о протеолитических ферментах млекопитающих. Результаты актуальны как в области фундаментального естествознания для изучения основных компонентов протеолитического аппарата клетки и понимания базовых основ его функционирования в норме и патологии, так и в прикладном аспекте (биомедицина, фармацевтика) поиска подходов к регуляции протеолитических процессов, лежащих в основе патологических перестроек в тканях.

Сделан вывод о перспективности выбранного направления исследований, адекватности методических приемов для решения поставленных задач и о необходимости дальнейших исследований сложного баланса строго регулируемой физиологической и персистентной патологической активности кальпаинов, нарушение которого лежит в основе патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний.