2.3.5 Вестерн-блот анализ
Вестерн-блот анализ по тестированию количества кальпастатина включал разделение тканевых белков (30 мкг на дорожку) методом электрофореза в 12% ПААГ в присутствии SDS (Laemmli, 1970) с последующим полусухим переносом полипептидов на нитроцеллюлозную мембрану (буфер: 48 мМ Трис-HCl, 39 мМ глицин, 0.0375% SDS, 20% метанол, pH 9.2). После инкубации (2 ч, 20°C) мембраны в буфере TBS (50 мМ Трис-HCl-буфер, 150 мМ NaCl, pH 7.5) проводили блокировку сайтов неспецифического связывания 5% раствором обезжиренного молока в буфере TBST (TBS с добавлением 0.1% Tween 20, pH 7.5) в течение 1 ч. Далее мембрану подвергали последовательному экспонированию с поликлональными антителами к кальпастатину (разведение 1 : 2500 в буфере TBST; 1 ч) и с антителами к IgG кролика, конъюгированными с пероксидазой (разведение1 : 2000 в буфере TBST; 1 ч); каждый из указанных этапов завершался многократной отмывкой буфером TBST. Мембрану подвергали стандартной обработке системой Immune-Star (Bio-Rad, США).
2.3.6 Другие методы
Концентрацию белка во фракциях определяли методом Брэдфорд (Bradford, 1976) с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) в качестве стандарта.
Денситометрия полос на зимограммах и рентгеновской пленке проводилась с помощью стандартной программы “Image J”.
Статистическую обработку данных проводили с применением общепринятых методов вариационной статистики с использованием пакетов программ MS Excel и StatGraphics. Достоверность различий оценивали с помощью непараметрического критерия U (критерий Вилкоксона-Манна-Уитни), а также с использованием однофакторного дисперсионного анализа (Коросов, Горбач, 2007).
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение
В серии экспериментов была изучена активность кальпаин / кальпастатиновой протеолитической системы при развитии индуцированной нейропатологии у крыс. О функциональной активности этой системы в условиях эксперимента судили по уровню протеолитической активности доминирующих форм кальпаинов (μ- и m-кальпаинов) и количественному содержанию их эндогенного ингибитора – кальпастатина. Для получения более полной картины изменений системы и с учетом роли аутокаталитической реакции в активации кальпаинов [1] методом зимографии с казеином определяли соотношение молекулярных форм μ- и m-кальпаинов, как полноразмерных, так и аутолизованных.
3.1 Интактные животные.
В норме, в разных отделах головного мозга крыс (исследованы кора больших полушарий и гиппокамп) основная активность кальпаинов определяется в цитоплазматической (растворимой) фракции: свыше 90% – для коры мозга, свыше 80% –для гиппокампа (рис. 1 и 2, соответственно).
Вместе с тем, учитывая эффект связывания этих протеиназ с мембранными фосфолипидами для их активации [1, 29], наиболее показательной представляется активность их минорной фракции, ассоциированной с мембранными структурами (грубой митохондриальной, микросомной, миелиновой). Соотношение пула кальпаинов в растворимой и мебраносвязанной фракциях для большинства тканей млекопитающих составляет 8–9 : 1 [1, 30] и аналогично полученным нами результатам. Кальпастатин обнаруживается во всех исследованных отделах мозга. Его уровень в физиологических условиях достаточен для полного угнетения активности всего пула кальпаинов [31], и тонкая регуляция этой протеолитической системы достигается за счет соотношения фермента и ингибитора в конкретном локусе клетки [1, 9].
Рис. 1. Активность кальпаинов при хронической амилоидной нейротоксичности. На графике: удельная активность кальпаинов в растворимой (1) и мембраносвязанной (2) фракциях коры больших полушарий. На врезке: зимограмма с казеином, демонстрирующая распределение молекулярных форм активных кальпаинов. По оси абсцисс: группы животных: 1 – интактные, 2 –ложнооперированные; 3 – инъекция пептида Аβ1-40; 4 – сочетанное действие пептида Аβ1-40 и 17β-эстрадиола.
Рис. 2. Активность кальпаинов при острой глутаматной нейротоксичности. На графике: удельная активность кальпаинов в растворимой (1) и мембраносвязанной (2) фракциях гиппокампа. На врезке: зимограмма с казеином, демонстрирующая распределение молекулярных форм активных кальпаинов. По оси абсцисс: группы животных: 1 – интактные, 2 –ложнооперированные; 3 – инъекция глутамата; 4 – сочетанное действие глутамата и нифедипина.