Контрольные вопросы.

1. Какие физические факторы оказывают влияние на жизнедеятельность микроорганизмов?

2. Какие вещества относятся к дезинфицирующим и как они различаются по механизму воздействия на микроорганизмы?

3. Перечислите какие взаимоотношения существуют между микроорганизмами?

4. Назовите способы стерилизации?

5. Что такое пастеризация, тиндализация?

6. В чем заключается метод стерилизации - фильтрованием?

7. Что такое биологическая стерилизация?

Раздел 5 основы иммунологии. Практическая работа №10

Серологическая реакция

Серологические реакции -реакции взаимодействия между антигена и антителом протекают в две фазы:

1-ая Фаза - специфическая - образование комплекса антигена и соответствующего ему антитела. Видимого изменения в этой фазе не происходит, но образовавшийся комплекс становится чувствительным к неспецифическим, факторам, находящимся, в среде (электролиты, комплемент, фагоцит);

2-ая фаза - неспецифическая. В этой фазе специфический комплекс антиген-антитело взаимодействует с неспецифическими, факторами среды, в которой происходит реакция. Результат их взаимодействия может быть, видим невооруженным глазом (склеивание, растворение и т.п.)

Различают реакции агглютинации, преципитации, связывания комплемента и др.

Применение серологических реакций. Одно из основных применений серологических реакций - лабораторная диагностика инфекций. Их используют:

1. для выявления антител в сыворотке больного, т. е. для серодиагностики;

2. для определения вида или типа антигена, например выделенного от больного микроорганизма, т. е. для его идентификации,

Посуда. Должна быть чистой и сухой. Применяют пробирки, пипетки градуированные и пастеровские, колбы, цилиндры, предметные и покровные стекла, чашки Петри, пластины из пластмассы с лунками.

Инструменты и оборудование. Петля, штативы; лупа, агглютиноскоп, термостат, холодильник, центрифуга, весы химические с разновесом.

Исследуемый материал.

Сыворотка крови -₁ это жидкая часть, выделяемая: после образования фибринового сгустка и осаждения форменных элементов.

Сыворотку обычно получают на второй неделе болезни, когда можно ожидать наличие в ней антител, иногда пользуются сыворотками выздоравливающих и переболевших.

Для получения сыворотки кровь берут из вены в количестве 3-5 мл в стерильную пробирку и направляют в лабораторию, сопровождая этикеткой, с указанием фамилии и инициалов больного, предполагаемого диагноза и даты.

Кровь следует брать натощак или не раньше чем через 6 ч после еды. В сыворотке крови после еды могут содержаться капельки жира,: которые делают ее мутной и не пригодной для исследования.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 ч при комнатной температуре или ставят в термостат при 37 С на 30 минут для образования сгустка.

Образовавшийся сгусток отделяют от стенок пробирки пастеровской пипеткой или петлей. Пробирку помещают в холодильник на некоторое время (обычно на 1 ч, но не более 48 ч) для лучшего отделения сыворотки из сжавшегося на холоде сгустка. Затем сыворотку отсасывают стерильной пастеровской пипеткой, снабженной резиновым баллоном или шлангом. Сыворотка должна быть совершенно прозрачной без примеси клеток.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определенной схеме соответствующим антигеном (вакциной). В полученной сыворотке; определяют ее титр (активность). Титр - наименьшее количество антител, которое склеивает данное количество антигена. Готовят сыворотки обычно на производстве.

Реакция агглютинации.

Реакция агглютинации основана на специфическом взаимодействии антител (агглютитинов) с целыми микробами или другими клетками. В результате взаимодействия образуются частицы агломераты, выпадающие в осадок, называемый агглютинатом. В реакции агглютинации могут участвовать бактерии, простейшие грибы, дрожжи, риккетсии, эритроциты и другие клетки, как живые, так и убитые. Причем, находящиеся в агглютинате микроорганизмы остаются живыми, но теряют свою подвижность. Протекает реакция в две фазе:

1) - соединение антигена с антителом;

2) -образование видимою агглютината.

Таким образом, реакция агглютинации - это склеивание и выпадение в осадок корпускулярных антигенов под действием специфических антител в присутствии электролита в корпускулярном виде. Для реакции нужны:

1. Антитела (агглютинины), содержащиеся в сыворотке больного или иммунной сыворотке.

2. Антигены - взвесь живых или убитых микроорганизмов, взвесь эритроцитов или других клеток.

3. Изотонический раствор хлорида натрия.

Реакцию применяют для серодиагностики при брюшном тифе, паратифах, бруцеллезе и др. Антителом при этом является сыворотка больного, а антигеном - известный микроб. При идентификации микробов или других клеток антигеном служит их взвесь, а антителом - известная иммунная сыворотка.

Реакция агглютинации на стекле.

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю взвеси стафилококков, каплю любой другой культуры и каплю физраствора. Капли на стекло наносят гак, чтобы между ними было расстояние. Восковым карандашом на стекле помечают, где какая капля. Во все капли добавляют по одной капле сыворотки, физраствор является контролем. Реакция протекает при комнатной температуре в течение 1-3 минут. Контроль останется прозрачным, в первой капле должны появиться хлопья агглютината, следовательно, здесь есть антитела, а во второй капле появится муть, в этом случае результат реакций считают положительным. При отрицательном результате реакции в первой капле будет видна равномерная муть.

Развернутая реакция агглютинации.

Берут 8 одинаковых пробирок, 2 из которых контрольные (КС - контроль сыворотки, КА - контроль антигена). Сыворотку больного обычно разводят от 1:50 до 1600, иммунную сыворотку разводят до титра или до половины титра (титром агглютинирующей сыворотки называют ее максимальное разведение, в котором она агглютинирует гомологичные клетки). На каждой пробирке указывают степень разведения сыворотки. На первой пробирке пишут номер опыта или название антигена.

В проб. №1 делается рабочее разведение путем добавления; 4,9 мл изотонического раствора хлорида натрия, к 0,1 мл сыворотки, разведения равно 1:50.

В проб. №2 1:100

В проб. №3 1:200

В проб. №4 1:400

В проб. №5 1:800

В проб. №6 1:1600

В каждую пробирку, кроме контроля сыворотки, начиная со второй, добавляют 1-2 капли антигена (диагностикума или свежеприготовленной взвеси бактерий). Пробирки помещают в термостат при 37°С. Предварительный учет результатов реакции производится через 2 часа, окончательный через 18-20 часов, В пробирках должны появиться зерна или хлопья агглютината, надосадочная жидкость может быть мутной, контроль сыворотки должен остаться прозрачным.

Учет результатов начинают с контролей. Контроль сыворотки должен оставаться прозрачным, контроль антигена - равномерно мутным. Результаты учитываются как + и - в зависимости от величины бляшки осадка. Интенсивность реакции: следующим образом:

++++ все клетки осели, жидкость в пробирке совершенно прозрачна. Результат реакции резко положительный.

+++ осадок меньше, нег полного просветления жидкости. Результат

реакции положительный.

++осадок еще меньше, жидкость мутная. Результат реакций слабо

положительный.

+ незначительный осадок, жидкость мутная. Сомнительный

результат реакции.

- осадка нег, жидкость равномерно мутная. Отрицательный результат реакции.