Практическая работа № 2

Тема: «Микроскопические методы исследования. Знакомство с микроскопом»

В микробиологических исследованиях применяют световые и электронные микроскопы: методы оптической и электронной микроскопии. Методы оптической и электронной микроскопии позволяют изучить форму, подвижность, окрашивание микроорганизмов, выявить наличие включений и ряд других особенностей клеток. Изучение, более мелких объектов: ультраструктурных особенностей микробной клетки, а также выявление вирусов, возможное при использовании электронного микроскопа.

Микроскопия в световом оптическом микроскопе.

В практической работе используются микроскопы МБР-1 (микроскоп биологический рабочий), МБИ-1(микроскоп биологический исследовательский), микроскопы Биолам ЛОМО и другие.

Основными частями микроскопа являются: механическая, оптическая и световая.

Механическая часть. К ней относятся: штатив, предметный столик, тубус, револьверная пластинка, винты для настройки на фокус.

Штатив состоит из: основания, тубусодержателя и тубуса.

Предметный столик укреплён на штативе. На него помещают микропрепарат. На предметном столике имеются 2 зажима (клеммы) для фиксации препарата. Через отверстия в предметном столике обеспечивается освещение объекта. На боковых поверхностях штатива имеются 2 винта, с помощью которых можно передвинуть тубус. Макрометрический винт служит для грубой настройки на фокус. Микрометрический винт используется для тонкой настройки на фокус.

Оптическая часть. В верхней части тубуса помещён окуляр. Он обращён к глазу исследователя и представляет собой систему линз. Окуляры могут давать разное увеличение: в 7 (х7), 10 (х10) и 15 (х15) раз.

На противоположной стороне тубуса находится вращающийся диск – револьверная пластинка. В её гнездах закреплены объективы. Каждый объектив представлен несколькими линзами и позволяет получить увеличение: 8 (х8), 40 (х40), 90 (х90) раз.

Общее увеличение микроскопа равно увеличению объектива, умноженное на увеличение окуляра.

Осветительная система микроскопа представлена зеркалом, конденсором и диафрагмой конденсора. Зеркало расположено в нижней части штатива и служит для направления светового пучка от источника на объект. Оно имеет плоскую и вогнутую поверхности. Плоскую поверхность используют при естественном освещении, вогнутую - при искусственном. Иногда к штативу прикрепляют осветитель ОИ-1 от которого свет направлен непосредственно на объект. Между зеркалом и предметным столиком находится конденсор. С помощью конденсора регулируют освещённость объекта. Диафрагма конденсора служит для регуляции освещения объекта.

Микроскопия в тёмном поле

Исследование основано на явлениях рассеивания света при сильном боковом освещении взвешенных в жидкости частиц. Метод позволяет увидеть более мелкие частицы, чем в световом микроскопе, осуществляется с помощью светового микроскопа, снабжённого конденсорами (параболоид - или кардиоид - конденсор), который создаёт полый конус света. Вершина конуса совпадает с объектом. Лучи света проходят через объект исследования в косом направлении, не попадают в объектив микроскопа. В него проникает свет, рассеянный объектом. Поэтому на тёмном фоне препарата наблюдаются ярко светящиеся контуры микробных клеток и других частиц. Метод позволяет определить форму микроба и его подвижность. Обычно этот метод используют при исследовании микроорганизмов которые слабо поглощают свет (спирохеты). Для создания темного поля можно использовать конденсор Аббе, поместив в центр его кружок чёрной бумаги. Свет устанавливают и центрируют по световому полю, а затем затемняют конденсор Аббе.

Препарат готовят по методу раздавленной капли. Толщина предметного стекла не должна превышать 1-1,1 мм. Иначе фокус конденсора придётся в толщину стекла. Между конденсором и предметным стеклом помещают жидкость (дистиллированная вода) с показателем преломления близким к показателю преломления стекла. При правильной установке света на тёмном поле видны яркие светящиеся точки.

Фазово-контрастная микроскопия.

Метод основан на том, что живые клетки и микроорганизмы, слабо поглощающие свет, тем не менее способны изменять фазу проходящих через них лучей. Фазово-контрастная микроскопия осуществляется благодаря разности фаз, возникающих при прохождении света через живые объекты.

Люминесцентная микроскопия.

Метод основан на способности некоторых клеток и красителей светиться (люминесцировать) при попадании на них ультрафиолетовых или^: других коротковолновых лучей света. Для люминесцентной микроскопии используется обычный световой микроскоп с источником лучей ультрафиолета или генератором других коротковолновых лучей спектра. Большинство микроорганизмов не обладают флюоресценцией, поэтому их окрашивают красителями – флюорохромами: акридин, аурамин, корифосфин и др.

Электронная микроскопия

В электронном микроскопе вместо света использован поток электронов.

Для определения деталей структуры микроорганизма используют методы:

1. Метод напыления. На поверхность препарата напыляют тонкий слой

(7 нм) из тяжёлых различных металлов: хром, золото, палладий. Напыление производят в вакууме. Частички металла в виде паров оседают на возвышающихся участках поверхности исследуемого объекта.

2. Метод негативного контрастирования. На препарат наносят растворы, содержащие атомы тяжёлых металлов (фосфорно-вольфрамовая кислота). Осаждаясь около белковых частиц и заполняя все имеющиеся пространства, атомы тяжёлых металлов создают «окрашенный» фон, на котором

выявляются мельчайшие детали строения микроорганизмов.

После изготовления объекта изучения проводят электронную микроскопию. Увеличение электронного микроскопа составляет 50.000 раз, но отдельные структурные элементы можно увеличить до 300.000 раз. Также возможно получение увеличенного изображения на фотографии.

Контрольные вопросы.

1. Из каких основных частей состоит микроскоп?

2. Как правильно настроить свет в микроскопе?

3. В чём принцип фазово-контрастной микроскопии?

4. На чём основана темнопольная микроскопия и когда её используют?

5. На чём основана люминесцентная микроскопия?

6. Что такое электронный микроскоп и какова его разрешающая способность (увеличение)?