Глава 3. Конкретные примеры исследования лекарственных веществ на лабораторных животных.

3.1. Изучение местнораздражающего действия препарата тодикамп на функции жизненно важных органов

Препарат тодикамп представляет собой сочетание очищенной фракции нефти под наименованием "Ленефр" с размельченными зелеными плодами грецкого ореха в стадии молочной зрелости. Тодикамп защищен патентом РФ. Показатели стандарта препарата и его свойств приведены в соответствующих работах. Имея общее с препаратом чеблин — СК-1, тодикамп характеризуется также своими отличительными особенностями, На добровольцах установлено, что тодикамп обладает выраженной противовоспалительной активностью, а его ранозаживающая активность превосходит таковую лучшего зарубежного препарата солкосерил. По раздражающему действию тодикамп превосходит мазь "Финалгон" [3, 4, 8]. В странах СНГ препарат превратился в средство народной медицины и больные начали им пользоваться бесконтрольно. Целью исследования явилось изучение местнораздражающего действия препарата тодикамп и его влияния на функции жизненно важных органов.

Экспериментальная часть

Проведено две серии экспериментов. Первая из них проведена на рандоимбредных белых крысах-самцах массой 208—216 г и кроликах Шиншилла массой 2,3—3,0 кг. Тодикамп и растворитель наносили на выстриженную кожу животных ежедневно в течение 30 дней в двух дозах. У крыс площади аппликации составляли 1 и 16 см2, на которые наносили соответственно 1 и 4 капли (0,25 и 0,1 мл) изучаемых веществ. У кроликов площади аппликации были 16 и 56 см2, на них наносили соответственно 4 и 16 капель (0,1 и 0,4 мл) тодикампа или растворителя. В период проведения экспериментов наблюдали за состоянием, поведением и внешним видом животных, еженедельно оценивали динамику массы тела. Через 14, 30 и 60 дней проводили обследование животных по физиологическим, гематологическим и биохимическим показателям. Состояние ЦНС у крыс оценивали по ряду поведенческих показателей (ориентировочная двигательная активность и эмоциональная реактивность в тесте "открытое поле", норковый рефлекс), кроме того, определяли способность к суммации подпороговых импульсов (СПИ). У всех животных регистрировали частоту дыхания и терморегуляцию.[8]

Состояние сердечно-сосудистой системы оценивали по ЭКГ во II отведении. При гематологическом обследовании в периферической крови подсчитывали количество эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов и тромбоцитов, определяли концентрацию гемоглобина, резистентность эритроцитов (минимальную и максимальную), цветовой показатель и лейкоцитарную формулу по состоянию лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и нейтрофилов (сегментно- и палочкоядерных). Состояние свертывающей системы крови оценивали в тесте определения времени свертывания и по коагулограмме с регистрацией начала, продолжительности и окончания процессов свертывания, а также динамики скорости свертывания на 1-,2- и 3-й минуте.

При биохимическом обследовании оценивали функциональное состояние жизненно важных органов и систем, для чего исследовали сыворотку крови, мочу и липиды надпочечников. Для оценки функционального состояния печени определяли активность аланиновой и аспарагиновой трансаминаз, щелочной фосфатазы и концентрацию общего белка в сыворотке крови. О функции почек судили по уровню белка и мочевины в сыворотке крови, а также по показателям диуреза, экскреции белка и хлоридов с мочой. Учитывая раздражающий характер воздействия тодикампа, в программу испытаний включили оценку функционального состояния надпочечников по фракционному составу липидов и показателям интенсивности эстерификации холестерина и соотношения липолитических и липосинтетических процессов. Для этого регистрировали процентное содержание фофолипидов, свободного холестерина, неэстерифицированных жирных кислот, триглицеридов и эфиров холестерина. Показатели липидного обмена в надпочечниках позволяли также судить о влиянии тодикампа на липидный обмен в целом. В исследованиях использовали общепризнанные методы и унифицированные для биохимических лабораторий СССР и России методы исследований с последующим анализом на спектрофотометре "Спекол-221".

Вторая серия экспериментов проведена на 21 крысе, 21 кролике, 21 собаке. Ежедневно в течение 30 дней на кожу 7 крыс, 7 кроликов, 7 собак (контроль) наносили дистиллированную воду, другим животным (7крыс, 7 кроликов, 7 собак) — тодикамп. У крыс площадь обработки составляла 16 см2 (0,1 мл), у кроликов — 56 см2 (0,4 мл), у собак — 56 см2 (0,8 мл). Такому же количеству животных и в таких же дозах наносили на кожу растворитель тодикампа. В этой серии экспериментов, помимо использованных тестов исследования, в первой серии экспериментов определяли белковые фракции и содержание свободных аминокислот в сыворотке крови, лейкоцитарный индекс интоксикации, холестерин, триглицериды, общий билирубин, креатинин, выполняли тимоловую пробу, устанавливали содержание в крови нуклеиновых кислот, а также кальция, калия, натрия, глутаминтрансферазы. Проводили и другие исследования (иммунологические, морфологические, микробиологические, генетические, гельминтологические, протозоологические).[9]

По окончании периода воздействия веществ (30 дней) и через 20—30 дней восстановительного периода животных забивали, подвергали вскрытию, внутренние органы (печень, сердце, селезенка, почки, надпочечники, щитовидная железа, семенники, мозг) взвешивали и обрабатывали для гистологических исследований.

В период проведения двух серий экспериментов подопытные животные чувствовали себя хорошо, шерстный покров был гладким, двигательная активность, активность поедания корма были такими же, как у животных, получавших аппликации растворителя, и у контрольных животных, которым на кожу наносили дистиллированную воду. Масса тела крыс при воздействии тодикампа в течение первых 14 дней эксперимента не отличалась от контроля. После 30-дневных аппликаций тодикампа и растворителя отмечено отставание прироста массы тела крыс. После отмены препаратов в течение первых 14 дней масса тела крыс достигла уровня контроля, а в дальнейшем, через 30 дней, немного превышала этот уровень. В течение экспериментов масса тела кроликов и собак не отличалась в группах, т.е. аппликация на кожу животных (собак и кроликов) тодикампа и растворителя не повлияла на прирост массы тела животных.

В ходе обследования крыс по поведенческим тестам через 14 дней воздействия не было отмечено отклонений по изученным показателям, за исключением незначительного снижения одного из факторов эмоциональной реактивности (груминга) у крыс, которым наносили растворитель на большую площадь тела. Через 30 дней наблюдали слабое увеличение двигательной активности в группах крыс, получавших меньшую дозу тодикампа и растворителя, и незначительное возрастание эмоциональной реактивности при воздействии растворителя. После отмены препаратов эти изменения исчезали во всех группах животных. Через 14 дней у крыс, которым на кожу наносили тодикамп, наблюдали незначительное снижение величины СПП, указывающее на повышение реактивности животных в ответ на раздражение нервных окончаний конечностей током возрастающего напряжения. Однако это изменение было весьма слабым, не выходящим за пределы колебаний физиологической нормы этого показателя. Обследование животных через 30 дней после отмены аппликаций не выявило изменений СПП и температуры тела в опыте по сравнению с контролем. В эксперименте у животных (крысы, кролики, собаки) показатели электрической активности сердца по ЭКГ находились в пределах нормы.

При обследовании крыс после аппликаций тодикампа наблюдали слабые и легкообратимые изменения гематологических показателей (снижение цветового показателя и ускорение процессов свертывания крови). После воздействия растворителя выявили также некоторое снижение уровня гемоглобина, резистентности эритроцитов, количества тромбоцитов и процента содержания моноцитов. Напротив, показатели общего анализа крови кроликов и собак в течение всего эксперимента были без особенностей и оставались в границах физиологической нормы. После 14-дневного ежедневного нанесения на кожу крыс растворителя, входящего в состав тодикампа, в меньшей дозе развиваются несущественные изменения в обмене веществ, которые проявляются умеренным повышением гликемии, снижением активности аспарагиновой трансаминазы, экскреции белка и хлоридов с мочой. При воздействии большей дозы растворителя картина реакции изменяется. Практически восстанавливаются до уровня контрольных животных исследуемые показатели крови и мочи. Появляются изменения в липидном составе надпочечников: уменьшается доля эфиров холестерина на фоне тенденции увеличения относительного содержания его свободной фракции, т.е. снижается активность эстерификации холестерина (коэффициент эстерификации 1,64 при 2,27 у животных контрольной группы). Отмеченные изменения носят умеренный, независимый от дозы характер и, по-видимому, в большей степени связаны с местным раздражающим действием вещества. Необходимо также отметить, что тодикамп по некоторым показателям оказывает противоположное керосину, входящему в состав препарата чеблин — СК-1, действие. Так, например, керосин в меньшей дозе снижает диурез и экскрецию хлоридов, а тодикамп в этой же дозе восстанавливает нарушенные показатели. Иное действие тодикамп оказывает и на липидный состав надпочечников, прежде всего на относительное coдepжaниe неэстерифицированных жирных кислот и триглицеридов, что проявляется повышением их соотношения, которое достигает 0,57 и 0,43 при 0,25 у животных контрольной группы. Эти изменения можно расценивать как сдвиг в сторону преобладания липолитических процессов над липосинтетическими, возможно, вследствие фармакологического действия тодикампа. Подобных явлений не отмечено у кроликов и собак. При ежедневном нанесении тодикампа и растворителя на кожу крыс в течение 30 дней происходит, по-видимому, адаптация со стороны надпочечников, сохраняются лишь слабовыраженные изменения относительного содержания триглицеридов. Отмеченный антидиуретический эффект растворителя и тодикампа трудно обсуждать, так как у контрольных крыс диурез в течение эксперимента возрастал в 2 раза. После 30-дневной аппликации тодикампа и 30-дневного восстановительного периода разница в содержании белка и хлоридов, в количестве почти суточной мочи у животных контрольной группы и апплицированных тодикампом была статистически высокодостоверна (р< 0,01), а остальные биохимические показатели сыворотки крови, липидов надпочечников находились на уровне контроля. Можно предположить, что растворитель и тодикамп предупреждают увеличение диуреза, вызванного алиментарным воздействием, а также тормозят выведение белка с мочой. У кроликов в течение эксперимента изученные биохимические показатели находились в пределах физиологической нормы. В первой серии экспериментов у крыс через 30 дней после отмены накожного нанесения растворителя восстанавливаются практически все показатели, кроме слабого увеличения мочевины в сыворотке крови, но эти изменения не могут быть расценены как токсические, поскольку имеют изолированный характер и практически укладываются в пределы показателей животных контрольной группы. Во второй серии экспериментов при тщaтeльном изyчeнии aминoкиcлoтного обмена у крыс, которым наносили тодикамп в высоких дозах в течение 30 дней, не выявлено его нарушения. В суточной моче животных контрольной и апплицированной тодикампом групп не отмечено статистически достоверной разницы в выделении аминокислот. В первой серии экспериментов у крыс, которым тодикамп наносили накожно, наблюдается как бы отсроченная реакция, повторяющая в некоторых чертах результаты данных (14 дней) наблюдений. Так, при нанесении малой дозы можно отметить увеличение диуреза на фоне тенденции гиперпротеинурии, в то время как на большую дозу животные реагировали значительным уменьшением диуреза и снижением экскреции хлоридов с мочой. Кроме того, при большей дозе тодикампа в липидном составе надпочечников наблюдаются такие же изменения, как при ежедневном нанесении в течение 30 дней меньшей дозы. Изученные нами показатели крови собак, где между группами нет статистически достоверной разницы, а также данные аминокислотного обмена, биохимические анализы мочи и надпочечников показали полную безвредность тодикампа при 30-дневном накожном нанесении его в высоких дозах. Вторая серия экспериментов, проведенная на крысах, не подтвердила побочного действия тодикампа, полученного в первой серии экспериментов. Тем не менее к воздействию тодикампа на почки мы относимся с осторожностью.[3]

Выводы

1. Животные (крысы, кролики, собаки) хорошо переносят ежедневные, в течение одного месяца, аппликации тодикампа на кожу: до 4 капель в сутки крысам, до 16 капель — кроликам, до 32 капель — собакам.

2. В течение первых 14 дней эксперимента у всех подопытных крыс и кроликов после аппликации тодикампа и растворителя наступают обратимые признаки местнораздражающего действия в виде гиперемии кожи и появления тонких корочек.

3. У крыс после аппликации тодикампа наблюдаются слабые и легко-обратимые изменения гематологических показателей (снижение цветового показателя и ускорение процессов свертывания крови). После воздействия растворителя, кроме того, выявляется некоторое снижение количества гемоглобина, резистентности эритроцитов и процента моноцитов, а также количества тромбоцитов.

4. У подопытных животных изменения метаболических показателей были весьма слабыми и характеризовали особенности биологических эффектов растворителя и фармакологического действия тодикампа.

5. У кроликов и щенят применение тодикампа и растворителя не вызывает нарушения функций жизненно важных органов. Отмечено слабое увеличение мочевины в сыворотке крови, а после отмены препарата — снижение количества ретикулоцитов, незначительное ускорение свертывания крови.

6. При клиническом испытании тодикампа необходимо контролировать состояние периферической крови и функцию почек.[4]