- •3. Регуляция каталитической активности ферментов
- •1. Оксидоредукпшзы
- •2.Трансферты
- •3.Гидролазы
- •4. Лиазы
- •5. Изомеразы
- •6. Лигазы (синтетазы)
- •1. Конкурентное ингибирование
- •2. Неконкурентное ингибирование
- •1. Специфические и неспецифические ингибиторы
- •2. Необратимые ингибиторы ферментов как лекарственные препараты
3. Регуляция каталитической активности ферментов
Важнейшее значение в изменении скорости метаболических путей играет регуляция каталитической активности одного или нескольких ключевых ферментов данного метаболического пути. Это высокоэффективный и быстрый способ регуляции метаболизма.
Основные способы регуляции активности ферментов:
аллостерическая регуляция;
регуляция с помощью белок-белковых взаимодействий;
регуляция путём фосфорилирования/дефосфорилирования молекулы фермента;
регуляция частичным (ограниченным) протеолизом.
Аллостерическая регуляция
Аллостерическими ферментами называют ферменты, активность которых регулируется не только количеством молекул субстрата, но и другими веществами, называемыми эффекторами. Участвующие в аллостерической регуляции эффекторы - клеточные метаболиты часто именно того пути, регуляцию которого они осуществляют.
Роль аллостерических ферментов в метаболизме клетки. Аллостерические ферменты играют важную роль в метаболизме, так как они чрезвычайно быстро реагируют на малейшие изменения внутреннего состояния клетки. Аллостерическая регуляция имеет большое значение в следующих ситуациях:
при анаболических процессах. Ингибирование конечным продуктом метаболического пути и активация начальными метаболитами позволяют осуществлять регуляцию синтеза этих соединений;
при катаболических процессах. В случае накопления АТФ в клетке происходит ингибирование метаболических путей, обеспечивающих синтез энергии. Субстраты при этом расходуются на реакции запасания резервных питательных веществ;
для координации анаболических и катаболических путей. АТФ и АДФ - аллостерические эффекторы, действующие как антагонисты;
для координации параллельно протекающих и взаимосвязанных метаболических путей (например, синтез пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, используемых для синтеза нуклеиновых кислот). Таким образом, конечные продукты одного метаболического пути могут быть аллостерическими эффекторами другого метаболического пути.
Аллостерические эффекторы. Эффектор, вызывающий снижение (ингибирование) активности фермента, называют отрицательным эффектором, или ингибитором. Эффектор, вызьгоаюший повышение (активацию) активности ферментов, называют положительным эффектором, или активатором.
Аллостерическими эффекторами часто служат различные метаболиты. Конечные продукты метаболического пути - часто ингибиторы аллостерических ферментов, а исходные вещества - активаторы. Это так называемая гетеротропная регуляция. Такой вид аллостерической регуляции очень распространён в биологических системах.
Более редкий случай аллостерической регуляции, когда сам субстрат может выступать в качестве положительного эффектора. Такая регуляция называется гомотропной (эффектор и субстрат - одно и то же вещество). Эти ферменты имеют несколько центров связывания для субстрата, которые могут выполнять двойную функцию: каталитическую и регуляторную. Аллостерические ферменты такого типа используются в ситуации, когда субстрат накапливается в избытке и должен быстро преобразоваться в продукт.
Выявить ферменты с аллостерической регуляцией можно, изучая кинетику этих ферментов. Эти ферменты не подчиняются законам Михаэлиса-Ментен, они имеют характерную S-образную кривую зависимости скорости реакции от концентрации субстрата.
Особенности строения и функционирования аллостерических ферментов:
обычно это олигомерные белки, состоящие из нескольких протомеров или имеющие доменное строение;
они имеют аллостерический центр, пространственно удалённый от каталитического активного центра;
эффекторы присоединяются к ферменту нековалентно в аллостерических (регуляторных) центрах;
аллостерические центры, так же, как и каталитические, могут проявлять различную специфичность по отношению к лигандам: она может быть абсолютной и групповой. Некоторые ферменты имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к активаторам, другие - к ингибиторам.
протомер, на котором находится аллостерический центр, - регуляторный протомер, в отличие от каталитического протомера, содержащего активный центр, в котором проходит химическая реакция;
аллостерические ферменты обладают свойством кооперативности: взаимодействие аллостерического эффектора с аллостерическим центром вызывает последовательное кооперативное изменение конформации всех субъединиц, приводящее к изменению конформации активного центра и изменению сродства фермента к субстрату, что снижает или увеличивает каталитическую активность фермента (рис. 2-30);
регуляция аллостерических ферментов обратима: отсоединение эффектора от регуляторной субъединицы восстанавливает исходную каталитическую активность фермента;
аллостерические ферменты катализируют ключевые реакции данного метаболического пути.
Локализация аллостерических ферментов в метаболическом пути. Скорость метаболических процессов зависит от концентрации веществ, использующихся и образующихся в данной цепи реакций. Такая регуляция представляется логичной, так как при накоплении конечного продукта он (конечный продукт) может действовать как аллостерический ингибитор фермента, катализирующего чаще всего начальный этап данного метаболического пути:
Фермент, катализирующий превращение субстрата А в продукт В, имеет аллостерический центр для отрицательного эффектора, которым служит конечный продукт метаболического пути F. Если концентрация F увеличивается (т.е. вещество F синтезируется быстрее, чем расходуется), ингибируется активность одного из начальных ферментов. Такую регуляцию называют отрицательной обратной связью, или ретроингибировани-ем. Отрицательная обратная связь - часто встречающийся механизм регуляции метаболизма в клетке.
В центральных метаболических путях исходные вещества могут быть активаторами ключевых ферментов метаболического пути. Как правило, при этом аллостерической активации подвергаются ферменты, катализирующие ключевые реакции заключительных этапов метаболического пути:
Схема, поясняющая работу аллостерического фермента. А - действие отрицательного эффектора (ингибитора); Б - действие положительного эффектора (активатора).
Регуляция каталитической активности ферментов белок-белковыми взаимодействиями. Некоторые ферменты изменяют свою каталитическую активность в результате белок-белковых взаимодействий. Рассмотрим 2 механизма активации ферментов с помощью белок-белковых взаимодействий:
активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков;
изменение каталитической активности ферментов вследствие ассоциации или диссоциации протомеров фермента.
Активация ферментов в результате присоединения регуляторных белков. Этот тип регуляции можно рассмотреть на примере активации фермента аденилатциклазы, локализованной в плазматической мембране клетки.
Активный центр аденилатциклазы локализован на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Активированная аденилатциклаза катализирует реакцию образования из АТФ циклического 3',5'-АМФ (цАМФ) - вторичного, внутриклеточного посредника действия гормонов (см. схему ниже).
В мембране аденилатциклаза функционирует в комплексе с другими белками:
рецептором гормона, выступающего во внеклеточную среду и взаимодействующего с гормонами;
с G-белком, занимающим промежуточное положение между рецептором и ферментом аденилатциклазой. G-белок - олиго-мерный белок, состоящий из 3 субъединиц - α, β, γ. α-Субъединица имеет центр связывания и расщепления ГТФ. Поэтому этот белок называется ГТФ-связывающим белком, или G-белком;
в результате связывания гормона с рецептором происходит изменение конформа-ции G-белка, уменьшение его сродства к молекуле ГДФ, с которой он связан в отсутствие гормонального сигнала, и увеличение сродства к ГТФ. Присоединение ГТФ вызывает конформационные изменения в G-белке и диссоциацию его на субъединицы: субъединицу α, связанную с ГТФ (α-ГТФ), димер βγ;
α-ГТФ имеет высокое сродство к аденилатциклазе, его присоединение приводит к активации последней, поэтому α-ГТФ - регуляторный белок, а данный механизм активации аденилатциклазы называют активацией ферментов в результате присоединения регуляторных белков (рис. 2-32).
Регуляция каталитической активности ферментов ассоциацией/диссоциацией протомеров Протеинкиназы - группа ферментов, катализирующих перенос остатка фосфорной кислоты с АТФ на специфические ОН-группы аминокислотных остатков белков (вызывают фосфорилирование белков). Механизмы активации различных протеинкиназ неодинаковы. В качестве примера регуляции каталитической активности ферментов ассоциацией или диссоциацией протомеров можно привести регуляцию активности фермента Протеинкиназы А.
Протеинкиназа А (цАМФ-зависимая) состоит из 4 субъединиц 2 типов: 2 регуляторных (R) и 2 каталитических (С). Такой тетрамер не обладает каталитической активностью. Регуляторные субъединицы имеют участки связывания для циклического 3',5'-АМФ (цАМФ), по 2 на каждую субъединицу. Присоединение 4 молекул цАМФ к 2 регуляторным субъединицам приводит к изменению конфор-мации регуляторных протомеров и к диссоциации тетрамерного комплекса, при этом высвобождаются 2 активные каталитические субъединицы (рис. 2-32). Такой механизм регуляции обратим. Отщепление молекул цАМФ от регуляторных субъединиц приведёт к ассоциации регуляторных и каталитических субъединиц Протеинкиназы А с образованием неактивного комплекса.
Регуляция каталитической активности ферментов путём фосфорилирования/дефосфорилирования
В биологических системах часто встречается механизм регуляции активности ферментов с помощью ковалентной модификации аминокислотных остатков. Быстрый и широко распространённый способ химической модификации ферментов - фосфорилирование/дефосфорилирование. Модификации подвергаются ОН-группы фермента. Фос-форилирование осуществляется ферментами протеинкиназами, а дефосфорилирование - фосфопротеинфосфатазами. Присоединение остатка фосфорной кислоты приводит к изменению конформации активного центра и его каталитической активности. При этом результат может быть двояким: одни ферменты при фосфорилировании активируются, другие, напротив, становятся менее активными.
Изменение активности фермента, вызванное фосфорилированием, обратимо. Отщепление остатка фосфорной кислоты осуществляется ферментами фосфопротеинфосфатазами. Активность протеинкиназ и фосфопротеинфосфатаз регулируется гормонами, что позволяет быстро изменять активность ключевых ферментов метаболических путей в зависимости от условий внешней среды. Антагонистичные по функции гормоны противоположным образом влияют на фосфо-рилирование/дефосфорилирование ферментов, вызывая противоположные эффекты изменения метаболизма клетки.
Например, под действием глюкагона (в период между приёмами пищи) в клетках происходит уменьшение синтеза энергетического материала - жира, гликогена и усиление его распада (мобилизация), вызванного фосфо-рилированием ключевых ферментов этих процессов. А под действием инсулина (во время пищеварения), наоборот, активируется синтез гликогена и ингибируется его распад, так как взаимодействие инсулина с рецептором активирует сигнальный путь, приводящий к дефосфорилированию тех же ключевых ферментов.
Регуляция каталитической активности ферментов частичным (ограниченным) протеолизом
Некоторые ферменты, функционирующие вне клеток (в ЖКТ или в плазме крови), синтезируются в виде неактивных предшественников и активируются только в результате гидролиза одной или нескольких определённых пептидных связей, что приводит к отщеплению части белковой молекулы предшественника. В результате в оставшейся части белковой молекулы происходит конформационная перестройка и формируется активный центр фермента.
Рассмотрим механизм частичного протеолиза на примере активации протеолитического фермента трипсина (рис. 2-34). Трип-синоген, синтезируемый в поджелудочной железе, при пищеварении по протокам поджелудочной железы поступает в двенадцатиперстную кишку, где и активируется путём частичного протеолиза под действием фермента кишечника энтеропептидазы. В результате отщепления гексапептида с N-конца формируется активный центр в оставшейся части молекулы. Следует напомнить, что трипсин относят к семейству "сериновых" протеаз - активный центр фермента содержит функционально важный остаток Сер.
Частичный протеолиз - пример регуляции, когда активность фермента изменяется необратимо. Такие ферменты функционируют, как правило, в течение короткого времени, определяемого временем жизни белковой молекулы. Частичный протеолиз лежит в основе активации протеолитических ферментов, белков свёртывающей системы крови и фибринолиза, белков системы комплемента, а также пептидных гормонов.
Каждый фермент имеет 2 названия. Первое - короткое, так называемое рабочее, удобное для повседневного использования. Второе (более полное) - систематическое, применяемое для однозначной идентификации фермента.
А. Рабочее название
В названии большинства ферментов содержится суффикс "аза", присоединённый к названию субстрата реакции, например уреаза, сахараза, липаза, нуклеаза или к названию химического превращения определённого субстрата, например лактатдегидрогеназа, аденилатциклаза, фосфо-глюкомутаза, пируваткарбоксилаза. Согласно российской классификации ферментов (КФ), названия ферментов пишутся слитно. Однако в употреблении сохранился ряд тривиальных, исторически закреплённых названий ферментов, которые не дают представления ни о субстрате, ни о типе химического превращения, например трипсин, пепсин, ренин, тромбин.
Б. Классы ферментов
Международный союз биохимии и молекулярной биологии в 1961 г. разработал систематическую номенклатуру, согласно которой все ферменты разбиты на 6 основных классов в зависимости от типа катализируемой химической реакции. Каждый класс состоит из многочисленных подклассов и подподклассов с учётом преобразуемой химической группы субстрата, донора и акцептора преобразуемых группировок, наличия дополнительных молекул и т.д. Каждый из 6 классов имеет свой порядковый номер, строго закреплённый за ним.