Факторы фолдинга
Фолдинг белков изучают следующим образом: вначале разрушают нативную структуру с помощью специальных агентов, т.е. вызывают его денатурацию, а затем наблюдают за восстановлением исходной структуры (ренатурацией или рефолдингом). О состоянии белка судят с помощью разнообразных спектральных методов, а также по его функциональной активности. Такие эксперименты показали, что ренатурация эффективно происходит для небольших белков, например рибонуклеаза. В случае более крупных белков денатурация часто сопровождается агрегацией, а самопроизвольный рефолдинг если и происходит, то очень медленно и с весьма небольшим процентом выхода. Вместе с тем показано, что добавление в среду некоторых белковых фракций клетки значительно облегчает рефолдинг денатурированных белков.
Отсюда и возникло представление о вспомогательных белках (или факторах) фолдинга. Данные факторы разделяют на 2 группы:
белки с каталитической активностью, т.е. ферменты фолдинга – фолдазы. Как и прочие ферменты, они требуются лишь в каталитических количествах, т.е. в концентрациях, на порядок меньше, чем у «обслуживаемых» ими белков.
молекулярные шапероны - белки с разными механизмами действия, объединенные на основании того, что они требуются в количествах, близких к стехиометрическим, т.е. сравнимых по величине с концентрацией сворачиваемых белков, но как и фолдазы они не входят в состав конечных продуктов фолдинга.
Ферменты фолдинга
К настоящему времени выявлены и изучены два фермента фолдинга -
протеиндисульфидизомераза (ПДИ) и пептидилпролилизомераза (ППЛ).
1.3.1.1. Протеиндисульфидизомераза (ПДИ)
ПДИ катализирует перемещение в белках дисульфидных связей. Под его влиянием в сворачиваемом белке разрываются одни и вместо них замыкаются другие дисульфидные связи. Например известно, что белок РНКаза состоит из 124 аминокислотных остатков. Из них 8 остатков цистеина, что допускает 105 различных комбинаций замыкания между ними 4-х дисульфидных связей ( по законах комбинаторики, количество возможных комбинаций равно произведению нечетных чисел от 1 до n, т.е. 3х5х7=105). Из этих комбинаций только одна является правильной. Без ПДИ замыкание первых попавшихся 4-х дисульфидных связей навсегда зафиксировало бы пептидную цепь в соответствующей конформации, даже если последняя далека от нативной и энергетически невыгодна. Дисульфидные связи являются ковалентными и для их разрыва требуется преодолеть высокий кинетический барьер. Таким образом, лабилизация дисульфидных связей в формирующимся белке дает возможность найти (путем случайного перебора) такую комбинацию этих связей, которой соответствует энергетически наиболее оптимальная пространственная структура.
В клетке ПДИ связана в основном с эндоплазматической сетью. Поэтому особенно велика ее роль в формировании тех белков, которые синтезируются мембраносвязанными рибосомами. Это экспортные, мембранные и лизосомные белки.
1.3.1.2. Пептидилпролилизомераза (ППЛ). Известно, что пролин и продукт его гидроксилирования – гидроксипролин не является аминокислотой т.к. его радикал связан не только с углеродным атомом, но и с азотным. Поэтому образуется не амино-, а иминокислота (рис.1.7). Это сказывается на пространственной конфигурации пептидной цепи в месте содержания пролина. Здесь не образуется ни -спирали , ни -структуры, и пептидная цепь часто делает изгиб в ту или иную сторону. Причем возможность изгиба определяется тем, как расположены радикал соседней аминокислоты и радикал пролина относительно плоскости соответствующей пептидной связи (вращения вокруг которой невозможны). Радикалы находятся в транс-конфигурации, если расположены по разные стороны плоскости, и в цис–конфигурации, если находятся с одной стороны.
В
отсутствии резкого изгиба пептидной
цепи предпочтительней транс-конфигурация,
т.к. при ней соседние радикалы не «мешают»
друг другу.
В случае изгиба по принципу «поворот на себя» (т.е. почти на 1800) часто более оптимальной является цис-конфигурация, когда оба соседних радикала оказываются с наружной стороны изгиба.
ППИ катализирует переход радикалов в области пептидной связи пролина из транс-конфигурации в цис-конфигурацию и обратно. При этом происходит временный разрыв данной пептидной связи, разрешая поворот вокруг ее плоскости, после поворота связь снова замыкается. Таким образом, ППИ позволяет пептидной цепи в области пролина делать такие изгибы, которые приводят к оптимальной пространственной структуре.
Рис 1.7. Реакция пептидил-
пролилизомеразы