Глава 2
ФИЗИОЛОГИЯ ТРАНСГЕННОГО РАСТЕНИЯ
Вот уже в течение нескольких лет не утихают дискуссии вокруг трансгенных растений. Безвредны ли они, или таят в себе угрозу здоровью человека? Эта проблема обсуждается и в нашей и зарубежной научной прессе. Только в 2000 и в начале 2001 годов появились десятки статей на эту тему. Один из выходов из создавшегося положения видится в возможности применения трансгенных растений в первую очередь для использования в странах третьего мира, страдающих от бедности и нехватки продовольствия [1]. Однако эти рекомендации, в основе которых очевидно лежит желание помочь голодающим людям, воспринимаются все же с каким-то внутренним сопротивлением, подобно тому, когда недостаточно проверенные или не очень безвредные фармакологические препараты рекомендуются для "третьих стран" и не допускаются к продаже в развитых странах. Физиологи растений также активно участвуют в дискуссии о трансгенных растениях, пытаясь найти оптимальное решение наболевшего вопроса [2, 3, 4]. Однако, практически все исследователи констатируют наличие двух точек зрения. Первой придерживаются сторонники необходимости продолжать исследования и получать генетически модифицированные организмы, второй - сторонники ограничения и даже прекращения подобных работ.
Тем не менее один из авторов [5], ссылаясь на данные, приведенные Джеймсом в глобальном обзоре коммерческого использования трансгенных растений, приводит интересную динамику. Оказывается, всего лишь за 4 года количество плантаций трансгенных растений в мире увеличилось с 1,7 (1996 г.) до 39,9 миллионов га (1999 г.). То есть с одной стороны идет непрекращающаяся дискуссия, а с другой стороны многие фирмы получают и широко используют новые трансгенные формы растений в промышленных масштабах, что еще в большей степени обостряет дискуссию, особенно со стороны экологической общественности.
Во многих дискуссионных вопросах может помочь разобраться относительно новое научное направление – физиология трансгенного растения. Это направление сейчас энергично разрабатывается в ряде стран и имеет своей целью установление тех изменений в физиологии и биохимии растений, которые возникли в результате переноса генов. В самом деле, чем полнее мы будем знать об изменениях в метаболизме трансгенного организма, тем увереннее сможем сделать вывод о возможности его широкого использования для пищевых или технических целей. Высказываются опасения, что целевые гены далеко не всегда встраиваются в одинаковом числе и "попадают" в одни и те же места в геноме модифицируемого растения, кроме того, при попадании в мобильные элементы генома они очевидно могут включаться в процесс мобильного перемещения и этим самым вызывать дополнительные изменения, хотя и вероятность этих событий невелика.
В работах по генной инженерии в генетические векторы, помимо целевых генов специально вводят сопутствующие репортерные и селективные гены. Это обычно гены "чужие" для растения, например, ген, кодирующий синтез -глюкуронидазы, или ген кодирующий синтез флюоресцирующего белка медузы. В качестве селективных генов, чаще всего используют гены устойчивости к антибиотикам [6] и гербицидам (например, ген NPTII, кодирующий синтез неомицинфосфотрансферазы, обеспечивающей устойчивость к канамицину, bar-ген, кодирующий фосфинотрицинацетилтрансферазу, или ген goх, кодирующий глифосатоксидазу). Можно обосновать безвредность для человека вводимых селективных и репортерных генов, в том числе генов, кодирующих синтез флюоресцирующих белков, позволяющих проводить первичный массовый отбор трансгенных растений, а в дальнейшем наблюдать сохранение экспрессии в потомстве. Однако, строго говоря, при создании новых форм пищевых растений, может быть и не стоит стремиться к обязательному использованию маркерных генов. Это, конечно, усложняет установление и отбор трансгенных растений, но зато избавляет их от внесения дополнительного “генетического мусора”. Инсерцию же в геном целевых генов можно контролировать широко применяемыми сейчас методами саузерн-блоттинга, полимеразной цепной реакции, а их экспрессию определять или по увеличению конечного продукта реакции, кодируемой целевым геном или используя нозерн и вестерн-блоттинг [7]. Об изменениях в других звеньях метаболизма можно узнать, проводя физиологические исследования трансгенных растений.
В физиологии трансгенного растения сейчас определилось несколько направлений.
Первое, о котором уже говорилось, - это изучение метаболизма трансгенных растений и установление его отличий от генетически немодифицированных. Это направление активно развивается и мы имеем много примеров, когда при модификации растений не только заранее просчитываются возможные изменения в результате переноса целевого гена, но тщательно изучаются биохимические и физиологические последствия произведенной генетической модификации.
Такие работы представляют особый интерес и имеют важное значение для теории и практики генной инженерии.
Второе направление в физиологии трансгенного растения связано с использованием генной инженерии как метода для выяснения механимзма важных физиологических процессов. Генная инженерия здесь открывает дополнительные возможности. Например, в изучении созревания плодов оказалось перспективным манипулирование активностью алкогольдегидрогеназы путем введения соответствующего гена в сенсовой ориентации [8].
В исследованиях метаболизма ИУК и в связи с этим его влияния на гормональный статус растений, их рост и развитие, оказалось весьма перспективным введение гена ugt из кукурузы, кодирующего высокоактивную УДФГ-трансферазу. В результате было установлено, что трансгенные растения обладают повышенной способностью к связыванию ИУК в лабильное соединение с глюкозой, создавая таким образом значительный пул легко реиммобилизуемой ИУК, которая может в сильной степени интенсифицировать ростовые процессы у трансгенного растения. Оказалось также, что при введении гена ugt может происходить связывание не только ИУК, но и гербицида 2,4 Д, в результате чего растения приобретают устойчивость к высоким концентрациям этого соединения [9, 10]. При этом происходят также существенные изменения и в активности полифенолоксидазы. В клубнях трансгенного картофеля ее активность значительно ниже, следствием чего является резкое уменьшение “почернения” клубней на срезах.
Весьма интересны и перспективны исследования механизма ростовых процессов и клубнеобразования у картофеля при помощи трансгенных растений с введенными генами инвертазы и rol С [11, 12].
Серьезные успехи достигнуты в изучении функций экстензинов при помощи получения трансгенных форм на основе серии генов выделенных из различных растений [13]. Есть и другие примеры изучения физиологических функций путем введения различных генов. В работе [14] приводятся результаты изучения ауксиннезависимого роста клеток моркови при помощи гена trp. из A.tumefaciens. В последние годы значительно активизировались исследования генов, кодирующих синтез стрессовых белков и использования этих генов для изучения функциональных особенностей белков возникающих при различных воздействиях [15, 16].
В целом использование трансгенных растений для изучения стрессовых ответов разного типа, включая и механизмы защиты от патогенов, следует признать весьма перспективным [17].
И, наконец, третье направление связано с изучением интегральных физиологических процессов, таких, например, как устойчивость, рост и развитие растений, которые, в принципе, должны кодироваться полигенными системами. Однако нередко отмечается, что кодирование индивидуальными целевыми генами вызывает физиологические ответы широкого спектра. Например, введение генов acb и acp, кодирующих синтез ацилсвязывающих и ацилпереносящих белков, особенно в сочетании с геном ugt часто вызывает более сильную интенсификацию роста, чем под влиянием одного гена ugt. Замечено также, что эти гены оказывают влияние и на устойчивость растений, повидимому через стабилизацию мембранных систем (см. статью А.В.Чепинога и др. в настоящем сборнике). Введение гена Fe sod или Mn sod, кодирующих синтез супероксиддисмутазы, помимо специфического влияния на ход цепных реакций перекисного окисления, также влияют и на ростовые процессы (см. статью Ю.М.Константинова и др. в настоящем сборнике), и на устойчивость. В работе Мак Керси [18] введение гена Mn sod приводило к значимому улучшению перезимовки люцерны. Введение же гена ugt в антисенсовой ориентации [19] у той же люцерны сильно сказывалось и на фенотипе растения (фертильность, образование соцветий, морфология и число цветочных почек, количество пыльцы и т.д.). Эта реакция в принципе объяснима, так как ген ugt меняет гормональный статус, но ответ растения, судя по диапазону изменений, оказывается весьма широким.
Интересный результат получен также с индуцированной устойчивостью к недостатку бора, путем трансгенеза растений табака, в результате которого отмечена более интенсивная реутилизация бора из зрелых тканей и использование его в молодых растущих органах [20].
В заключение необходимо отметить, что разделение проблем, решаемых с помощью физиологии трансгенных растений, на три направления является в какой-то мере условным, но оно тем не менее отражает тенденции, сложившиеся к настоящему времени в этой ветви физиологии растений. В целом же, физиология трансгенного растения являет собой востребованное временем направление физиологической науки, призванное реализовать новые возможности как в самой физиологии растений, так и в решении проблем экспрессии генетической информации у трансгенных растений, помочь ответить на все еще дискуссионные вопросы об использовании генетически измененных растений для производства продуктов питания, технических целей, в фармакологии и медицине.
Из важных задач, тоящих перед физиологией трансгенного растения, следует признать изучение длительности наследования приобретенных физиологических признаков, закрепление их в потомстве. В этой проблеме большое значение имеет дальнейшее изучение механизма замолкания генов, а также исследование экспрессии генетических конструкций в различных условиях влияния абиотических факторов (индуцибельная экспрессия).
В будущем, вероятно, будет необходимо при создании трансгенных форм растений выработать перечень требований к характеристике трансгенного растения, составление своеобразного физиологического паспорта генетически измененного организма.
Это во многом бы помогло не только избежать поспешного продвижения в широкую практику новых трансгенных растений, но и создало бы базу для выработки необходимого доверия со стороны потребителей и общественности.
Саляев Р.К.
(Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск)
Литература
Chrispeels M.J. // Plant physiology. 2000. V. 124. P. 3-6.
Somerville Ch. // Plant physiology. 2000. V. 123. P. 1201-1202.
Potrykus I. // Plant physiology. 2001. V. 125. P. 1157-1161.
Романов Г.А. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. C. 343-353.
Borlaug N.E. // Plant physiology. 2000. V. 124. P. 487-490.
Angenon G., Dillenw, Van Montagu M. // Plant molecular biology manual. 1994. C1. P. 1-13.
Memelink J.Swords K.M., Staehelin L.A., Hoge J.H., // Plant molecular biology manual. 1994. F1. P. 1-23.
Speirs J., Lee E., Holt K., Kim Yong-Dik, Scott N.S., Lovers B., Schuch W. // Plant physiology, 1998. V. 117. P. 1047-1058.
Рекославская Н.И., Жукова В.М., Саляев Р.К., Бандурский Р.С., Кузнецова Е.В. // Докл. РАН. 1997. Т. 356. № 6. С. 825-829.
Рекославская Н.И., Жукова В.М., Чеканова Е.Г., Саляев Р.К., Мапелли С.П., Гаманец Л.В. // Физиология растений. 1999. Т. 46. № 5. С. 699-710.
Romanov G.A., Konstantinova T.N., Sergeeva L.I., Golyanovskaya S.A., Kossmann J., Willmitzer L., Schmulling T., Aksenova N.P., // Plant cell reports. 1988. V. 18. P. 318-324.
Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Голяновская С.А., Коссманн Й., Вилльмитцер Л., Романов Г.А. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 420-430.
Жаме Э. Гуззарди П., Салва И. // Физиология растений, Т. 47. № 3. С. 360-369.
Кузнецова Е.В., Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Гаманец Л.В., Еникеев А.Г. // Физиология растений. 1998. Т. 45. № 5. С. 716-724.
Cushman J., Bohnert H., // Current opinion in plant biology. 2000. Т. 3. P. 117-124.
Kaye C., Neven L., Hofig A., Qin-Bao Li, Haskell D., Guy Ch. // Plant physiology. 1998. V. 116. P. 1367-1377.
Пирузян Э.С., Кобец Н.С., Метт В.Л., Серебрийская Т.С., Неумывакин Л.В., Ализаде Х., Ленец А.А., Симонова М.Л., Шевелуха В.С., Голденкова И.В. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 37-381.
Mc Kersie B.,Bowley S., Jones K. // Plant physiology. 1999. V. 119. P. 839-848.
Woo H., Orbach M.J., Hirsch A.M., Haves M.C. // The Plant Cell. 1999. V. 11. P. 2303-2315.
Brown P.H., Bellaloni N., Hening Hu, Dandekar A. // Plant physiology. 1999. V. 119. P. 17-20.