Глава 3

ХОЛОДОСТОЙКОСТЬ РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ, ТРАНСФОРМИРОВАННОГО ГЕНОМ ДРОЖЖЕВОЙ ИНВЕРТАЗЫ

Одной из ответных реакций растений на неблагоприятные температурные воздействия принято считать увеличение активности гидролитических ферментов, сопровождающееся повышением содержания низкомолекулярных соединений, в первую очередь углеводов. Показано, что соотношение разных форм сахаров в клетках является одним из важных факторов низкотемпературной адаптации [1].

В связи с этим особый интерес представляют гидролитические ферменты углеводного метаболизма, в частности, инвертаза, активно гидролизующая молекулу сахарозы с образованием двух молекул моносахаров и тем самым меняющая углеводный статус растения.

Задачей работы было изучения зависимости холодоустойчивости растений от характера углеводного метаболизма и работы гидролитических ферментов. В качестве объекта исследования были выбраны нетрансформированные и трансформированные растения картофеля (Solanum tuberosum L. cv. Desire) с введенным геном дрожжевой инвертазы (апопластный вариант локализации фермента) под контролем промотора пататина класса I (B33) [2, 3]. Растения выращивали в течение 4-х недель in vitro на агаризованной (0,7 %) питательной среде Мурасиге-Скуга, содержащей 2 % сахарозы и витамины (мг/л): тиамин – 0,5; пиридоксин – 0,5; мезоинозит – 60,0.

Растения картофеля по своей реакции на низкую температуру относятся к холодостойким, но не морозостойким растениям, за исключением дикого вида картофеля, который может выживать после слабых заморозков. Культурные сорта картофеля способны переносить температуру до - 1,5⁰ С, более низкая температура способствует образованию льда. Льдообразование всегда смертельно для этой культуры. Следовательно, воздействуя низкими положительными температурами, трудно выявить различия между контрольными и трансформированными растениями картофеля.

Стояла методическая задача - подобрать такие условия краткосрочного действия отрицательной температуры, при которых бы начинались повреждения клеток, но, в зависимости от степени холодостойкости объектов, выражались бы в разной степени. Поскольку низкотемпературный стресс, прежде всего, отражается на состоянии мембранного комплекса клеток тканей, для его регистрации был использован метод Декстера [4], основанный на определении электропроводности водных экстрактов из тканей растения.

Для выявления четких различий в показателях холодостойкости контрольных и трансгенных растений картофеля необходимо было подобрать такое сочетание отрицательной температуры с продолжительностью ее действия, которое бы не вызывало кристаллизации льда и гибель клеток, и ткани оставались бы в переохлажденном состоянии, но при этом были бы частично поврежденными, хотя и в разной степени.

Сначала контрольные и трансгенные растения были предварительно проморожены при температурах порядка –8-9⁰ С в течение 30 минут. Как показали результаты, при этих условиях не было обнаружено различий в холодостойкости изучаемых вариантов (таблица, опыт 2). Это указывает на то, что получасовое действие отрицательной температуры не вызывало существенных повреждений тех и других клеток, что и не позволило установить различий в устойчивости контрольных и трансгенных растений.

Таблица. Использование разных температурных воздействий на листья контрольных (К) и трансгенных (Т) растений картофеля для выявления различий в их холодостойкости.

№ опыта	Температура и время замораживания, ^0С, мин.	Вариант (растения)	Холодостойкость, % до и после промораживания
1	22^0С	К Т		59 59
2	-8-9^0С, 30 мин.	К Т	63 61	64 63
3	-12^0С, 10 мин. -12^0С, 50 мин.	К Т К Т		15 59 11 13
4	-12^0С, 20 мин.	К Т	51 55	27 40
5	-12^0С, 30 мин. -12^0С, 50 мин.	К Т К Т	55 62	16 59 10 14
6	-14^0С, 20 мин.	К Т		22 45

Следующий опыт (таблица, опыт 3) был проведен с воздействием более низкой температуры (-12⁰ С) в течение 10 и 50 минут, который показал четкие различия в холодостойкости листьев контрольных и трансгенных растений. Последние были более холодостойки, чем первые, причем существенные различия выявлены уже после 10-минутного промораживания. Более продолжительное - 50-минутное действие в данном опыте вызвало сильные повреждения растений обоих вариантов, выразившиеся в одинаково высокой степени выхода электролитов.

Как показал другой опыт, различия были обнаружены после 20-минутного промораживания при этой же температуре. Как видно из таблицы (опыт 4), в не промороженном состоянии растения не различались по выходу из них электролитов, тогда как после промораживания в течение 20 минут при –12⁰ С холодостойкость трансгенных растений превышала контрольные более чем в 1,5 раза. Эти же данные свидетельствуют о том, что 20-минутное промораживание вызывает повреждение как контрольных, так и трансгенных растений картофеля, но последние травмировались в гораздо меньшей степени.

В следующем опыте (5) продолжительность промораживания была увеличена до 30 минут и повторен опыт с 50 - минутным воздействием (при температуре –12⁰ С). В этом опыте также были выяснены существенные различия в холодостойкости между трансгенными, и контрольными растениями картофеля, причем особенно после 30-минутного промораживания. Однако увеличение этой температуры до 50 минут ликвидировало эти различия, как и в прежнем опыте.

В дальнейшем была сделана попытка снизить тестирующую температуру промораживания до -14⁰ С (длительность промораживания 20 мин.). Результаты одного из них, представленные в таблице (опыт 6) показывают, что такое сочетание температуры с продолжительностью ее действия было оптимальным для выявления разницы в холодостойкости контрольных и трансгенных растений, причем устойчивость последних в два раза превышала контрольный вариант.

На основании серии проведенных опытов можно сделать вывод, что для выявления различий в холодостойкости трансгенных и контрольных растений картофеля следует определять электропроводность водных экстрактов из листьев после 20-30 минутного промораживания при –12-14⁰ С. В не промороженном состоянии различий в холодостойкости обнаружить не удалось. Следует иметь в виду, что предлагаемый метод тестирования холодостойкости растений указывает лишь на относительную устойчивость к низкой температуре по отношению к контролю. Тестирующая температура не отражает абсолютную величину устойчивости, она лишь служит для выявления различий между вариантами, на основании которых можно судить об относительной устойчивости растений. Большинство проведенных определений показало, что картофель, трансформированный геном дрожжевой инвертазы, значительно превышал холодостойкость исходного контрольного варианта.

Трунова Т.И., Дерябин А.Н., Сабельникова Е.П., Алиева Г.П., Аксенова Н.П., Константинова Т.Н. (Институт физиологии растений им. К.А.Тимирязева РАН)

Литература

1. Klimov S.V., Astachova N.V., Trunova T.I. // J. Plant Physiol. 1999. V. 155. P. 734-739.

2. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Голяновская С.А., Шмюллинг Т., Коссманн И., Вильмитцер Л., Романов Г.А. // Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 592-599.

3. Аксенова Н.П., Константинова Т.Н., Голяновская С..А., Коссманн И., Вильмитцер Л., Романов Г.А. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 3. С. 420-430.

4. Hepburn H.F., Naylon F.L., Stokes D.I. // Ann. Appl. Biol. 1986. V. 108. P. 164-165.