Глава 4

ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ОСИНЫ, ОБЛАДАЮЩИХ УСКОРЕННЫМ РОСТОМ

Генно-инженерный подход к изменению свойств древесных растений привлекает в настоящее время большое внимание, при этом центральное место занимают базовые знания о фундаментальных биохимических путях и ключевых ферментов, интеграция генов которых может позволить направленно изменять метаболизм, форму, вид или качество древесных пород.

В настоящей работе для трансформации растений осины Populus tremula L. использовали ген ugt (iaglu), кодирующий УДФГ-трансферазу (тривиальное название ИУК-глюкозасинтаза) в эндосперме зерновки кукурузы, и ген acb из арабидопсиса, кодирующий ацил-КоА связывающий белок (ACBP).

Ранее ген ugt был введен в растения картофеля [1, 2] и томата [3], трансгенные формы которых выявили ускорение роста, корнеобразования и в конечном итоге увеличение продуктивности. УДФГ-трансфераза осуществляет связывание эндогенной ИУК, создавая запасной резерв ауксина для роста и процессов репродуктивного морфогенеза. Поэтому представлялось перспективным использовать ген ugt при попытке создания быстрорастущих форм осины в сочетании с геном acb, который, как предполагалось, оказывает влияние на мембранный статус органелл и устойчивость трансгенной осины к неблагоприятным условиям среды. Растения осины клонировали на среде Мурасиге и Скуга [4], содержащей 0,6 мг/л индоли-масляной кислоты (ИМК). Ген ugt клонировали в E.coli DH5 в pBluescript. Генacb клонировали в сенсовой и антисенсовой ориентациях в штаммах A. tumefaciens:

acb302=LB--\\--3'<-acb<-35S35S--35S->nptII->3’--RB acb303=LB-----35S35S->acb->3'--35S35S->acb->3'---35S->nptII->3'--\\--RB acb402=LB--\\--35S35S<-acb<-3'--35S->nptII->3'--RB acb404=LB--\\--35S35S<-acb<-3'--3'<-acb<-35S35S--35S->nptII->3'--RB acb501=LB-----35S35S->acb->3'---3'<-nptII<-35S---\\--RB acb502=LB--\\--3'<-acb<-35S35S--3'<-nptII<-35S--RB;

ген gus клонировали в E. coli K802 в pRT104. Для трансформации использовали также штамм A. tumefaciens 699, полученный ранее на основе A. tumefaciens EHA105 [5].

Трансконъюгант трехродительского скрещивания A. tumefaciens и двух штаммов E. coli получали при совместном выращивании бактерий на среде LB без антибиотиков, а затем высевали на селективные среды, содержащие 20 мг/л канамицина, 20 мг/л ампициллина и 100 мг/л карбенициллина. В препаратах плазмидной ДНК трансконъюганта проводили ПЦР с праймерами к генам acb и ugt.

Определение содержания ИУК проводили с помощью ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором на приборе ХЖ-1311 по ранее опубликованному методу [6]. Активность УДФГ-трансферазы определяли по методу [7]. Эксперименты проводили в трехкратной повторности. Значения представляют собой среднее квадратичное отклонение.

Растения осины инфицировали в пазухи листьев. В полученных растениях анализировали экспрессию маркерных генов gus и nptII и целевых генов acb и ugt. Оценку активности маркерного гена nptII, кодирующего неомицинфосфотрансферазу, осуществляли, помещая черенки осины на среду Мурасиге и Скуга, содержащую разные концентрации гентамицина. Через 4 недели выдерживания на среде с 15 мг/л гентамицина растения с сенсовой конструкцией acb501 в 10-15 раз превосходили по высоте контрольные растения, а по длине корневой системы различие между вариантами было примерно в 5 раз. Антисенсовая конструкция acb404 придавала растениям более высокую чувствительность к антибиотику в сравнении с контролем: их рост останавливался.

Активность маркерного фермента -глюкуронидазы изучали (табл. 1) по методу Jefferson et al [8]. Как видно из данных табл. 1, активность -глюкуронидазы в трансгенных растениях была достоверно выше.

Таблица 1. Активность -глюкуронидазы в растениях осины.

Вариант	Удельная активность, импульс/мг белка/час
контроль ugt ugt+acb501 ugt+acb502	203,919,2 265,76,9 457,413,9 311,110,8

Таким образом, трансгенные растения осины обнаружили экспрессию обоих маркерных генов. Для проверки интеграции целевых генов проводили Саузерн гибридизацию по стандартной методике [9], используя соответствующие зонды.

На рис. 1А представлены амплификаты гена acb, синтезированные по матрице геномной ДНК осины. При электрофорезе амплификатов обнаруживали единичную полосу размером в 290 пн, что соответствовало размеру этого гена. В контроле обнаружить амплификацию гена acb не удалось. Следует отметить, что независимо от типа использованной конструкции амплифицировались фрагменты одинакового размера, хотя число копий гена acb302 было значительно выше при амплификации плазмиды агробактерии с этим геном.

Рис. 1. Доказательства интеграции генов acb и ugt в геномную ДНК растений осины. А - ПЦР гена acb: в геномной ДНК растений осины: ДНК стандарт (1), контроль (2), ugt+acb302 (3), ugt+acb404 (4), ugt+acb502 (5); и в плазмидной ДНК бактерий с клонируемым геном acb: acb302 в pCNL65 A.tumefaciens C58 (6), acb302 в pBL121 E.coli DH5 (7), ДНК стандарт (8), acb302 в pBL121 E.coli DH5(9);Б - саузерн блот с зондом к гену acb: контроль (1), ugt+acb302 (2), ugt+acb404 (3), ugt+acb502 (4), acb302 в pCNL65 A.tumefaciens (5), acb302 в pBL121 E.coli DH5 (6);В - ПЦР фрагмента гена ugt 234 пн: контроль (1), ugt (2), ДНК стандарт (3), ugt в pBluescript E.coli DH5 (4);Г - ПЦР гена ugt 1416 пн: ДНК стандарт (1, 5), контроль (2), ugt (3), ugt в pBluescript E.coli DH5 (4).

Амплификация фрагментов гена ugt представлена на рис. 1В и Г. В ДНК трансгенной осины присутствовали последовательности, имеющие гомологию с геном ugt из кукурузы, клонируемым в плазмидной ДНК E.coli DH5.Об этом свидетельствует появление амплификатов размером 234 и 1800 пн в геномной ДНК, совпадающих по подвижности с фрагментами, амплифицированными по матрице кДНК генаugt, клонируемого в плазмиде E.coli DH5,при использовании соответствующих праймеров. В контроле сходных по размерам продуктов амплификации обнаружить не удалось, хотя участки гомологии и синтез низкомолекулярных продуктов амплификации получали при использовании праймеров к среднему фрагменту генаugt размером 234 пн.

Активность целевого фермента УДФГ-трансферазы определяли во фракции белка после осаждения 30 % (NH₄)₂SO₄ и в супернатанте, полученном после осаждения основной массы белка. Как было показано ранее [1, 2], в супернатанте после осаждения обнаруживалась самая высокая активность УДФГ-трансферазы в трансгенном картофеле, причем в контроле такой активности выявлено не было. На рис. 2 представлена удельная активность УДФГ- трансферазы растений осины. Можно видеть, что основная активность фермента была сосредоточена во фракции супернатанта, полученного после осаждения белков и, очевидно, экспрессия гена, кодирующего УДФГ-трансферазу из кукурузы, дополняла собственную активность, и поэтому суммарная активность УДФГ-трансферазы была более чем в 2 раза выше у трансгенных растений независимо от того, присутствовал ли ген acb. Очевидно, прямого взаимного влияния оба целевых гена друг на друга не оказывали и белковые продукты кодируемые ими, экспрессировались независимо.

Рис. 2. Активность УДФГ - трансферазы в растениях осины.

УДФГ-трансфераза представляет собой фермент, который осуществляет перевод ауксина в лабильное неактивное состояние, из которого ИУК способна выйти в активном виде и использоваться в ростовых процессах. Для оценки этого явления определяли содержание эндогенной ИУК в растениях осины. По данным табл. 2, содержание свободной ИУК было значительно выше в трансгенных растениях.

Таблица 2. Содержание ИУК в растениях осины, выращенных in vitro в течение 12 недель.

Вариант	ИУК, нмоль/г
контроль ugt ugt+acb302 ugt+acb404 ugt+acb501	0,250,04 0,660,18 1,070,34 0,440,11 0,360,07

Повышенное содержание эндогенной ИУК в трансгенных растениях коррелировало с более высокой скоростью их роста при выращивании на агаровой среде и в почве. В табл. 3 представлены данные морфометрического анализа растений, выращенных in vitro. За период выращивания в течение трех недель растения осины с введенным геном ugt опережали по высоте контрольные растения примерно в 3 раза, по развитию корневой системы в 6 раз. Добавочное внесение генов acb в сенсовой ориентации не усиливало какой-либо из этих морфометрических параметров и синергического эффекта введения двух генов не наблюдали. Растения с антисенсовыми конструкциями не превышали контроль, а в случае антисенсового расположения гена acb402 вблизи правой проксимальной и направляемой в геном растения (RB - right border) границы ТДНК наблюдали более слабый рост и развитие листьев и корней даже в сравнении с контролем.

Таблица 3. Морфометрический анализ клонируемых in vitro растений осины.

Вариант	Высота побега, мм	Суммарная длина корней, мм
Контроль	10,74,6	83,014,2
ugt	31,34,7	468,646,7
ugt+acb 302	18,12,9	144,72,9
ugt+acb 501	27,05,1	299,712,3
ugt+acb 502	16,66,4	171,04,7
ugt+acb 402	7,81,9	45,91,6
ugt+acb 404	12,94,7	56,16,2

При переносе растений в почву в условиях фитотрона наблюдали ускорение роста растений с совместным внесением целевых генов ugt и acb302 в сенсовой ориентации. Антисенсовые конструкции гена acb402 и acb404 проявили слабую жизнеспособность. После акклиматизации в условиях фитотрона в августе растения осины высадили в поле.

На следующий год растения развили мощный рост боковых побегов и значительный прирост в высоту. В табл. 4 представлены данные прироста растений осины через год после помещения их на делянки и суммарное развитие длины боковых ветвей. Можно видеть, что прирост в высоту в лучшем случае составлял превышение примерно в 30 % по сравнению с контролем, тогда как по длине боковых ветвей наблюдалось более чем двухкратное увеличение обшей длины ветвей.

В том случае, если для трансформации использовали только один ген acb (без гена ugt) растения осины с трудом укоренялись на агаровой среде или совсем погибали. Как показали наши эксперименты, синергический эффект двух генов выявился при выращивании в почве в условиях фитотрона или в условиях роста, приближенных к естественным. Это дает основание полагать, что ген acb усиливал адаптивные свойства трансгенных растений и облегчал их приспособление при переносе на открытый воздух. Связано ли это качество с оптимизаций жирокислотного состава мембранных структур клеток и стабилизацией мембран клеток – пока неясно, и выяснение причин этих явлений будет целью дальнейших исследований трансгенной осины.

Таблица 4. Рост побегов осины при выращивании в поле с 1998 по 1999 гг.

Вариант	Высота растения, см	Суммарная длина боковых побегов, см
Контроль	678,0	25820,2
ugt	731,3	31732
ugt+acb302	7731,5	49774
ugt+acb303	1019,0	54535
ugt+acb304	720,5	278106
ugt+acb501	7019,0	25665
ugt+acb502	8622,0	2800
ugt+acb504	358,0	170101
ugt+acb402	—*	—
ugt+acb404	—*	—

* - погибли при перенесении в почву

Таким образом, для трансформации растений осины целевых генов acb и ugt позволило получить растения с ускоренным темпом роста, что в перспективе может стать основой для создания плантаций с уменьшенным сроком ротации.

Саляев Р.К.¹, Чепинога А.В.¹, Рекославская Н.И.¹, Кузнецова Е.В.¹, Высоцкая Е.Ф.¹, Мапелли С.П.², Паковски Р.³

¹Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, г. Иркутск; ²Instituto biosintesi vegetali, C.N.R., г. Милан, Италия, ³Калифорнийская сельскохозяйственная научно-исследовательская станция, USDA, США

Литература

1. Жукова В.М., Рекославская Н.И., Саляев Р.К., Юрьева О.В. // Биотехнология. 1997. № 5. С. 15-21.

2. Рекославская Н.И., Жукова В.М., Саляев Р.К. и др. // ДАН. 1997. Т. 356. № 6. С. 825-829.

3. Rekoslavskaya N.I., Gamanezt L.V., Bryksina I.V. et al. // Tomato Genetics Cooperation Report. 1998. 48. P. 40-42.

4. Murashige, T., Skoog, F. // Physiol. Plantarum. 1962. V. 15. № 3. P. 474-497.

5. Gelvin S.B., Liu C.-N. // Plant Molecular Biology Manual. 1994. B. 4. P. 1-13.

6. Рекославская Н.И., Юрьева О.В., Шибанова Л.А., Саляев Р.К. // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 2. С. 227-234.

7. Kowalczyc, S., Bandurski, R.S. // Biochem. J. 1991. V. 279. № 3. P. 509-514.

8. Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., Bevan, M.W. // EMBO J. 1987. V. 6. № 13. P. 3901-3907.

9. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2^nd ed. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. V. 2.

Вместо заключения

ТРАНСГЕННЫЙ РЫНОК:

Можно ли стать мутантом, съев картошку

Что с нами станет, если мы будем питаться трансгенными морковками, помидорами и яблоками? Этот вопрос интересует политиков, финансистов, общественных деятелей, поскольку сейчас в сфере биотехнологий переплетено множество интересов, и пока не известно, что же определит будущее использования генетически измененных организмов и чье мнение окажется решающим.

Круг проблем, связанных с промышленным использованием трансгенных растений, можно разделить на медицинские, экологические и экономические. Специалисты в каждой области без устали спорят между собой, приводя убедительные аргументы как за, так и против.

ПОЗОВИТЕ ДОКТОРА!

С точки зрения здравоохранения до сих пор не выявлено никаких вредных побочных действий при употреблении новой пищи. Теоретически возможны аллергические реакции организма на ранее безопасные для него продукты, но пока таких случаев не отмечалось. С другой стороны, надо заметить, что даже если такие реакции были, их достаточно трудно отследить, поскольку от аллергии страдает огромное количество людей, многие из которых сами не знают, чем она вызвана. Но в целом страх за здоровье вызван скорее инстинктивным отвращением к новому и непонятному. Этот страх порождает новые, удивительные мифы — например, что встроенный ген может перенестись из съеденного картофеля в генетический код человека и вызвать мутации. Вероятно, подобные картины, достойные фильмов ужасов наподобие «Мухи», в котором перемешались гены человека и насекомого, и вызывают главную тревогу потребителей. Таким образом, маркирование продуктов, произведенных из трансгенных растений, является скорее вопросом этики, нежели безопасности. Любой человек имеет право знать, что он ест.

ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ ПРОГНОЗ

Экологов и представителей общественных движений вроде Green Peace беспокоят другие проблемы. Несмотря на тщательные и длительные лабораторные испытания и наблюдения, никаких точных данных о последствиях культивирования трансгенных растений нет. Самое печальное, что их и не может быть. Никакие лабораторные условия не смогут воссоздать колоссальную сложность реальной экологической системы, и последствия совершенно непредсказуемы. Вполне возможно, что ничего страшного не произойдет, хотя в США уже отмечен случай гибели бабочек одного исчезающего вида в районе посадок генетически измененного картофеля. Отмечены и обратные случаи — например, увеличение видового разнообразия птиц в районах произрастания генетически измененных зерновых. Среди возможных опасностей называют гибридизацию трансгенных культур с их дикими сородичами, результат которой может дать чрезвычайно устойчивый и приспособленный сорняк, непредсказуемую мутацию самих экспериментальных растений, оказать влияние на фауну местной территории. Однако даже эти предположения — всего лишь слабая попытка предсказать поведение такой невероятно сложной структуры, как экосистема.

Но, как всегда в случае с проектами, имеющими значение для всего мира, основные противоречия лежат в области экономики. Развитие биотехнологий сулит огромные прибыли для корпораций, занимающихся подобными разработками, и дает политикам возможность решать социальные проблемы.

МАННА ДЛЯ ГОЛОДНЫХ

В университете штата Невада было получено растение, способное накапливать значительные количества витамина Е. Общеизвестна важность этого витамина для обмена веществ человека. Его дефицит ускоряет старение организма, вызывает бесплодие, предрасположенность к атеросклерозу, сердечно-сосудистым заболеваниям, раку. Суточная норма витамина Е приблизительно равна 30 мг, и для того чтобы ее получить, необходимо съесть два килограмма шпината или почти килограмм соевого масла. Та же доза витамина содержится в одной чайной ложке масла, полученного из нового растения. Сейчас на планете от недостатка витамина Е страдают приблизительно два с половиной миллиарда человек, и эти люди не в состоянии покупать дорогостоящие пищевые добавки. Выращивание этого трансгенного растения могло бы им помочь.

В странах третьего мира, где население постоянно страдает от голода, выращивание устойчивых к местным условиям сортов измененных растений может решить многолетнюю проблему недоедания. Да и для России, где потери урожая картофеля от колорадского жука составляют больше трети, культивация растений, защищенных от этого вредителя, принесла бы много пользы. Кроме того, население планеты растет очень быстро, и не за горами момент, когда человечество столкнется с продовольственным кризисом.

УТРОМ – СТУЛЬЯ, ВЕЧЕРОМ...

Примеры можно приводить бесконечно. Преимущества генетически измененных растений всем очевидны. Однако встает вопрос: а чем же придется заплатить за эти блага?

Некоторые биологи считают, что делать ставку на абсолютно новый вид слишком опасно. Возможно, что через некоторое количество поколений новые культуры выродятся и урожаи начнут стремительно падать. Если к этому моменту трансгенные культуры завоюют мир, разразится небывалый кризис, сопровождающийся голодом и экономическими потрясениями в масштабах всей планеты.

Другой опасностью может стать разорение мелких фермеров, для которых стоимость измененных растений слишком высока (особенно если учесть, что разработаны виды, содержащие ген-«терминатор», который не позволяет использовать плоды этих растений для посадки). Таким образом, фермеры будут вынуждены постоянно закупать новые партии семян. Не исключено, что в силу подобных причин они будут вытеснены с рынка крупными производителями и тогда многие страны столкнутся с быстрым ростом безработицы. Подобная ситуация возникла в Юго-Восточной Азии во время так называемой зеленой революции 60—70-х годов, когда новые гибридные культуры и современные индустриальные методы ведения сельского хозяйства получили распространение в странах третьего мира. Резкий рост урожаев привел к разорению мелких фермеров и росту сельскохозяйственной безработицы.

ДЕНЬГИ РЕШАЮТ ВСЕ

Реальная подоплека страстей лежит, по всей видимости, в области не столько экологии и медицины, сколько в экономических интересах государств и могущественных транснациональных корпораций. Активное противостояние Европы трансгенной пище, которое привело к полному закрытию европейского рынка от подобной продукции, вызвано, скорее всего, защитой национального производителя от конкуренции с американскими экспортерами. Именно Америка сейчас — лидер на этом рынке и активно продвигает идею безопасности и выгодности трансгенных культур.

Корпорации — производители новых биотехнологий также пытаются прежде всего соблюсти свои финансовые интересы. Всевозможные совместные проекты, которые они запускают с научными и государственными учреждениями различных стран, ставят своей целью привлечение местного научного сообщества и общественного мнения на сторону идеи развития использования генетически измененных растений.

В этой экспансии особое место занимают Россия и ЮАР.

Южно-Африканская Республика стала для новых технологий как бы воротами в Африку. С одной стороны, это развитая страна с мощной инфраструктурой и научной базой. К тому же природные ресурсы и видовое разнообразие ЮАР так велики, что делают ее прекрасным местом для исследований в области биотехнологий, источником генетического материала и отличным полигоном. Уже сейчас южноафриканскими фермерами выращиваются два генетически измененных сорта кукурузы и один сорт хлопка. Также ЮАР имеет большое влияние на Африканском континенте и может способствовать дальнейшему продвижению трансгенных культур в глубь Черного континента. С другой стороны, страна сейчас переживает определенные трудности и сильно нуждается в источниках продовольствия. Общественное мнение ЮАР не слишком обеспокоено возможными опасностями использования трансгенных культур, а законодательная база в отношении генетических экспериментов слаба, как, впрочем, почти во всех странах.

Россия также стала желанной целью биотехнологических корпораций. Поскольку Западная Европа придерживается чрезвычайно жесткой позиции в этом вопросе, а восточноевропейские государства стремятся попасть в Евросоюз и, значит, поддерживают политику соседей, то Россия остается последним регионом на целом континенте, где возможно продвижение новых агрокультур. Вдобавок отсталость методов ведения сельского хозяйства в России очевидна, и технологии генной инженерии — соблазнительный путь для исправления ситуации. Что же касается экологических проблем, то, поскольку контроль за соблюдением экологических нормативов осуществляется у нас плохо, польза от снижения потребности в использовании ядохимикатов может перевесить негативные последствия развития трансгенных агрокультур.

Общественное мнение довольно индифферентно к данному вопросу, а законы почти не сформированы. Вступающее в силу с 1 июля постановление, согласно которому импортеры обязаны указывать наличие компонентов генетически измененных организмов в поставляемой продукции, вряд ли окажет влияние на процесс. А вот переговоры между американской биотехнологической корпорацией Monsanto и российскими разработчиками о совместном проекте по созданию нового сорта картофеля — факт, который может иметь важные последствия.

Таким образом, вопрос разработки и использования генетически измененных растений, скорее всего, будет решен не в ходе научной полемики и лабораторных испытаний и не под давлением общественного мнения, а в области голой прагматики и финансовых выгод. Предпринимая определенные популистские действия, призванные успокоить противников идеи, политики большинства стран допускают постепенное проникновение новых агрокультур на местные рынки и не торопятся накладывать запрет на произведенное из подобных культур продоволь- ствие: ведь использование биотехнологий и впрямь сулит значительные выгоды, а риск столь расплывчат. По всей видимости, это только вопрос времени, и остается надеяться, что плоды этих технологий и впрямь окажутся безопасными. Время покажет.

Для заметок

________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

40