Динамика научных публикаций по теме «прионы и прионные инфекции» до начала 90-х годов. По вертикальной оси – годы, по горизонтальной – количество
«Для тех, кто в эволюции привык видеть только
какое-то движение вперед и определенное целеустремление,
представление об эволюции и истории болезней неприемлемо.»
Френк Бернет*
НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ПАТОГЕНЫ: ПРИОНЫ**
Основные исследования в области эпидемиологии, инфекционной патологии, иммунологии применительно к сельскохозяйственным объектам традиционно направлены на заболевания, возбудителями которых являются канонические паразиты - гельминты, членистоногие, простейшие, грибы, бактерии, вирусы. Вместе с тем в последнее десятилетие важное значение приобрела категория патогенов необычной природы, к которой условно, только на основании их субвирусной, молекулярной организации можно отнести три группы патогенных агентов - прионы, вироиды и трансмиссивные (точнее, трансмиссибельные) генетические детерминанты патогенности (ТГД-П). Как показывает самый общий анализ явления, приведенный в таблице 13, возбудители этой категории - молекулярные патогены - ответственны за большое число опасных инфекций животных, растений и человека, в том числе эпидемических.
Инфекционные процессы, этиология которых обусловлена
неканоническими патогенами, сопровождаются всеми атрибутами инфекционно-паразитологических взаимоотношений, включая эпи- демический процесс как взаимодействие популяций возбудителя и хозяина в соответствии с теорией саморегуляции паразитарных систем (СПС) В.Д.Белякова (1983-1987). Явления инфекционной патологии, относящиеся к нижним уровням паразитизма, свидетельствуют, что пределы здесь далеко не ограничиваются каноническими бактериями и вирусами, достаточно аморфны и неопределенны. Вызываемые инфекционными белком и циркулярными ос-РНК прионные и вироидные инфекции - типичные унифакторные болезни. Вместе с тем ТГД-П ведут себя как генетические симбионты и даже паразиты per se, сами обусловливают инфекционный процесс при заражении бактериальных клеток как хозяев первого порядка и первичный эпидемический* процесс при их распространении в бактериальных популяциях, подчиняющийся закономерностям СПС. В данном случае понятие «условная патогенность» бактерий-реципиентов становится бессмысленным, но представляется чрезвычайно актуальным выяснение критической роли ТГД-П в проявлении вторичного эпидемического процесса в его тривиальном представлении при таких важных инфекциях, как отечная болезнь поросят и другие эшерихиозы, геморрагическая септицемия. Основной критерий истины при этом должен строится на аутэкологических посылках и самостоятельной эпидемиологии ТГД-П.
Вызываемые неканоническими патогенами патологические и эпидемиологические последствия чрезвычайно серьезны, они интенсивно изучаются как в теоретическом, так и прикладном отношении, однако наука в целом еще далека от окончательного понимания патобиологической и экологической сущности этой особой категории возбудителей. В их числе в отношении важнейших аспектов - патологии, диагностики, молекулярно-генетических механизмов патогенности на сегодняшний день наиболее изучены патогенные белки-прионы, активно исследуемые в силу известных эпизоотологических обстоятельств и особой актуальности вызываемых ими трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (ТГЭ). Вироиды до сих остаются в числе малоизвестных возбудителей, а ТГД-П - плазмиды, транспозоны и фаги - только
«приближаются» к концептуальному пониманию их роли в инфекционной патологии.
-----------------------------------------------------------
* Неканонические патогены - прионы, вироиды и ТГД-П - в настоящей работе рассматриваются применительно к инфекционной патологии животных, растений и человека, для которой в русскоязычной литературе в каждом случае приняты различные атрибутивные определения (эпизоото-, эпифитотио-, эпидемио-, соответственно). В связи с обобщающим характером излагаемых данных здесь выбран атрибут эпидемический как традиционно приоритетный или универсальный в зарубежной терминологии.
Вследствие этого, приведенный ниже обзорно-синтетический материал неравноценен в отношении неканонических возбудителей отдельных групп. Поэтому внимание сосредоточено на наиболее актуальных, интересных с точки зрения науки и практики элементах проблемы.
Прионы
Нозология. На текущий момент в литературе описаны 12 нозоединиц прионной этиологии: 6 болезней животных и 6 - человека .
Краткая история. Первое сообщение о скрепи - прототипной прионной инфекции - датировано 1732 годом. Однако только в 20-30-х годах н.в. на эту болезнь обращено внимание как на важную нозологическую форму. Этому во многом способствовал эпизоотологический инцидент массового заболевания скрепи овец ятрогенного происхождения в 1936 году в Англии, когда в результате прививки крупных контингентов этих животных против шотландского энцефалита вакциной из инактивированных формалином экстрактов лимфоидной ткани овец, оказавшихся инфицированными прион, заболели более 1500 голов. В то время, до известных фундаментальных обобщений по медленным инфекциям Бьерна Сигурдссона в 1954 г., были установлены заразная природа скрепи овец и коз, возможность иньекционной передачи возбудителя и распространения болезни с импортируемыми животными. Далее, с открытием и расшифровкой группой К. Гайдушека природы куру - первой прионной инфекции человека - в 1959-64 гг. были подробно изучены основные патоморфологические изменения в мозге больных животных и людей, воспроизведены экспериментальная скрепи у мышей, оральное заражение овец и коз. Показана наследственная природа восприимчивости к скрепи, определено содержание агента в тканях больных овец. В 1965-69 гг. установлены контактная и материнская трансмиссия возбудителя скрепи, получены первые данные о его необычных размерах и резистентности. Подробно описана ТЭН и ее причинная связь со скрепи овец. Устано-влена инфекционная природа БКЯ заражением шимпанзе,
получены доказательства штаммовой модификации агента скрепи пассажами на чувствительных животных и генетической регуляции продолжительности инкубационного периода болезни. В 1970 г. появилась первая в отечественной научной литературе публикация по прионным инфекциям американских авторов (Д.Ашер и др., 1970), показана возможность репродукции возбудителя в культуре клеток.
В 1971-79 гг. определена роль плаценты больных овец в оральной трансмиссии инфекции потомству, окончательно установлено значение генетических факторов восприимчивости овец к скрепи, охарактеризована необычная устойчивость агента к дезинфектантам и облучению, воспроизведено межвидовое заражение животных разных видов агентами различного видового происхождения. В 1980 г. С.Прузинер опубликовал первые результаты своих исследований, в частности, метод титрования агента скрепи на хомячковой модели по длительности инкубационного периода. В 1979 г. А.Дикинсон выдвинул этиологическую концепцию вирино, а в 1982 г. С.Прузинер - прионную концепцию этиологии ТГЭ. Суть последней сводится к постулированию инфекционности прионного белка при ТГЭ как возбудителя в тривиальном понимании, наличия у болезней этой группы инкубационного периода, трансмиссивности приона и его титрования по аналогии с другими возбудителями микро-биологической природы. Прионная концепция в конечном итоге получила признание в виде Нобелевской премии 1996 г.
Интерес к прионным инфекциям в значительной мере возрос после возникновения в Великобритании ГЭ КРС в 1986
Прион: белок, изоформы, гены, биологическое разнообразие. В настоящее время общепризнано, что инфекционный прион как возбудитель ТГЭ представляет собой белок с м.м. 27-30 кДа (PrP 27-30) и размером ~ 140 а.о.*, который образуется после частичного протеолиза патологической изоформы прионного белка (PrPSc). Последняя в свою очередь является производной от клеточной, нормальной изоформы (PrPC) вследствие конверсии PrPC Þ PrPSc. Клеточная изоформа образуется из продукта первичной трансляции гена прионного белка размером 254 а.о. после отщепления концевых участков. Обе изоформы PrP имеют м.м. 33-35 кДа, размер ~ 200 а.о. Клеточная изоформа идентифицирована у млекопитающих всех видов и птиц в виде заякоренной гликолипидом молекулы белка на клеточной поверхности, у здоровых животных содержится в концентрации ~ 1 мкг/г ткани мозга. Как показано в опытах на мышах, лишенных прионного белка, ее функции в норме, предположительно, заключаются в регуляции суточных циклов и динамики многих гормонов и циркадных ритмов в целом (6). Концентрация патологической изоформы PrP в мозге больных достигает ~ 10 мкг/г ткани и титров инфекционности > 9,5 lg ЛД50/г; она отличается от клеточной устойчивостью к протеолизу, гидрофобностью, тесной связью с гликолипидом, способностью к агрегации (амилоидогенности), вторичной структурой с высоким содержанием b-складчатых структур (~ 43% по сравнению с 2% у PrPC).
Конверсия изоформ прионного белка - очень медленный необратимый процесс в течение инфекции, происходящий вследствие нарушения кинетически контролируемого равновесия между ними в норме. Патологическая изоформа становится стабильной только в случае возникновения кристалла или агрегата, но реакция значительно ускоряется по мере возрастания ее количества в ходе конверсии или в присутствии экзогенного инфекционного приона.
Гены, кодирующие прионный белок (или «кандидаты» в прионные гены), идентифицированы у многих видов млекопитающих, у дрозофил, нематод, дрожжей (1). Они картированы, например, во 2 хромосоме у мышей, в 14 - у серебристой лисицы, в 20 - у человека. Их экспрессия и полиморфизм, аллельное состояние и комбинации обусловливают восприимчивость к прионным инфекциям, в частности, продолжительность инкубационного периода. Показана роль полиморфизма не менее чем 8 кодонов прионного гена у человека, 7 - у овцы. Доминантность аллелей и их комбинации определяют генотип восприимчивости от 0 до 100%.
Существует много штаммов инфекционных прионов «дикого» типа и модифицированных пассажами в экспериментальных условиях. Они стабильно различаются по характеристике экспериментальной инфекции, которая сохраняется после заражения животных иных видов. В качестве «лабораторных» маркеров штаммовой принадлежности используются продолжительность инкубационного периода при заражении линейных мышей, профиль специфических повреждений (полуколичественный критерий, основанный на определении частоты встречаемости вакуольных поражений в определенных нейроанатомических областях) и другие признаки (4).
Прионы и шапероны. В результате недавних исследований (5) были выяснены основные механизмы конформационной конверсии PrPC Þ PrPSc. Показано, что образование патологической изоформы прионного белка происходит не за счет физической агрегации или ассоциации PrPC с PrPSc, а при участии шаперонов, использующих PrPSc в качестве матрицы. Молекулярно-биологические функции, детерминируемые шаперонами, или молекулярными шаперонами (от англ. chaperon - временно сопровождающее лицо), - относительно недавно открытый дополнительный универсальный биосинте-тический этап, суть которого заключается в том, что при сборке мультимолекулярных или надмолекулярных биологических структур (например, клеточных, ферментных олигомерных агрегатов) требуется участие особых белков. Они не входят в состав конечного продукта, но необходимы для своевременного и правильного сворачивания полипептидной цепи агрегируемого белка, ее транспортировки к месту сборки и включения в агрегационный процесс. Благодаря этим исследованиям создана единая концепция образования прионов многоклеточных и одноклеточных организмов (по 1).
Патогенез. Основные патоморфологические признаки прионных инфекций - губкообразные изменения мозгового вещества, церебральный амилоидоз и астроцитоз. Двусторонняя симметричная вакуолизация нейронов приводит к тому, что ткань головного мозга на разрезе выглядит пористой. Различаются два морфологических типа губкообразных изменений - множественная микропузырьковая вакуолизация нейропилей серого вещества, типичная для ГЭ КРС, и крупные вакуоли, подобные полостям, в нейронном перикарионе, чаще наблюдаемые при естественной скрепи. Именно этот механизм обусловливает феномен потери нейронов. Установлено, что за такие нейропатологические изменения при ТГЭ ответственны отложения патологического прионного белка, поскольку их формирование предшествует дегенерации, а интенсивность и локализация совпадают.
Указанные отложения PrPSc как продукта нарушенного белкового обмена - не что иное, как диспротеиноз, потенциально способный к развитию амилоидоза со всеми типичными морфологическими, тинкториальными признаками и патологическими последствиями. Обнаруживаемые при ТГЭ амилоидные бляшки куру-типа, аналогичные образованным иными патологическими белками, состоят из филаментов гидрофобной, склонной к агрегации патологической изоформы прионного белка, обладают всеми свойствами амилоида и иммунореактивны с антителами к PrP. Наряду с типичными амилоидными бляшками куру-типа, компактными по морфологии, при ТГЭ встречаются мультицентрические амилоидные образования (патогномоничны для СГШ).
Реактивный астроцитоз как процесс заместительной гиперплазии в ответ на гибель нервной ткани заключается в разрастании астроцитарной нейроглии с гиперпродукцией глиальных волокон. Показано, что прионный белок (точнее, его синтетический пептид 106-126 а.о.) per se обладает нейротоксичностью и индуцирует астроглиальную пролиферацию, опосредованную микроглией. Астроцитоз при прионных инфекциях, наряду со стимулирующими его ограниченными повреждениями ЦНС, сопровождается появлением или увеличением количества в СМЖ некоторых белков, экспрессия которых в норме ассоциирована с развитием, дегенерацией и регенерацией нервной ткани, в частности, аполипопротеина Е, связанного с липидным обменом (по 2).
Диагностика. В настоящее время для диагностики прионных инфекций доступны и используются все общепринятые методические подходы - клинические, патоморфологические, иммунологические, биохимические, микробиологические, генетические. Этому во многом способствовало получение антиприонных антител и успешное решение тем самым серологических проблем тестирования прионного белка в связи с его известными биохимическими свойствами. Существующие диагностические критерии предусматривают их деление на:
основные - классические нейропатологические признаки, губкообразные изменения, астроцитоз (глиоз), потеря нейронов в отсутствие гистологических признаков воспаления (инфильтратов);
дополнительные - скрепи-ассоциированные фибриллы (САФ), белковый маркер в СМЖ, генотип (аллотип) восприимчивости, экспериментальная трансмиссия.
Окончательный диагноз на ТГЭ ставится на основании результатов выделения и идентификации патологической изоформы прионного белка, генотипа восприимчивости и данных иммуногистологии. Конкретные методы диагностики и их возможности сводятся к следующему.
Гистопатологический тест на основе приемов традиционной гистологии предусматривает выявление губкообразных изменений в мозговой ткани больных и определение профиля специфических повреждений. Его существенным недостатком, ограничивающим возможности широкого и технологического применения в производственно-ветеринарном контроле, является длительная (многодневная) формалиновая фиксация и обеззараживание патологического материала. С помощью иммуноцитохимического теста - обработки парафиновых срезов мозгового материала антителами к прионному белку с последующим иммуноферментным окрашиванием - выявляется иммунореактивный PrP in situ и представляется возможность оценки интенсивности его локальных отложений. Здесь существенно сокращается время анализа (до нескольких часов) и создаются преимущества сопряженного гистопатологического наблюдения и серологической идентификации агента. Вариантом метода иммуногистологии является иммуногистоблот - прием, основанный на принципе классического иммуноблотинга, предусматривающий перенос PrP с полномасштабных криостатных срезов мозга на нитроцеллюлозную мембрану и последующее иммуноферментное окрашивание отпечатков.
Биохимические тесты включают выделение и идентификацию САФ в грубых экстрактах мозга больных животных и белкового маркера в СМЖ. Последнее особенно важно для установления премортального диагноза на прионные инфекции; по опыту эпизоотии ГЭ КРС в Великобритании, только 85% случаев клинических подозрений подтверждается гистопатологически, в целом это составило более 25 тысяч голов безосновательно уничтоженного скота с убытками свыше 25 млн фунтов стерлингов.
Разработан метод диагностики скрепи овец путем выделения прионного белка из миндалин инфицированных животных (по содержанию приона относятся ко II категории органов и тканей с титром до 4.2 lg ЛД50/г) и его иммунохимического тестирования. Метод эффективен для постановки прижизненного диагноза, т.к. дает положительные результаты, начиная с 10-ти месячного возраста (клиническая форма скрепи обычно проявляется у овец старше 2 лет). Генетический анализ первичной структуры прионного гена с использованием ДНК, полученной антемортально из лейкоцитов крови, проводится с целью идентификации генотипа (аллотипа) восприимчивости и диагностики семейных форм ТГЭ.
Эпизоотология ГЭ КРС. Этот аспект прионных инфекций, включая болезни человека и новый вариант БКЯ, к настоящему времени достаточно хорошо исследован. Развитие эпизоотии ГЭ КРС в Великобритании и меры эпизоотологического надзора, а также спорадическая заболеваемость в других странах однозначно подтвердили результаты аналитических исследований относительно природы, происхождения и трансмиссии возбудителя . Сопряженный анализ эпизоотической кривой инцидентности общей и у животных, рожденных после законодательного запрета кормления мясокостной мукой, свидетельствует о значении последней как критического фактора в эпизоотическом процессе ГЭ КРС - инфекционной болезни со стереотипом кормовой тупиковой инфекции .
Прионы и конформационные болезни.
Прогресс в изучении прионов и сравнительный анализ аналогичных ситуаций в патологии позволили сделать неожиданный и важный вывод о том, что прионные инфекции по своей природе не являются исключительным явлением. Выяснение молекулярно-биологических механизмов образования инфекционного приона с новыми свойствами путем конформационной конверсии клеточного, физиологичного белка привело к обобщенному пониманию природы некой группы болезней, основу которой составили патологические состояния с объединяющим признаком диспротеиноза - образованием фибрилл, агрегатов белков или амилоида, такие как гемоглобинопатии (в частности, серповидно-клеточная), амилоидозы (более 10 патологических белков), включая прионные инфекции. Эта новая нозологическая категория получила объединяющее название конформационные болезни - различные патологические состояния с общими признаками диспротеинозов, сгруппированные по единому критерию - нарушению третичной структуры белков, причастных к этим заболеваниям.