1.2. Механизмы репликации
Репликация ДНК у прокариот и эукариот в общих чертах схожа. Однако, у эукариот этот процесс более сложен и менее изучен. Поэто му в изложении материала будем опираться, в основном, на процессы, происходящие у прокариот.
Репликация условно подразделяется на 3 стадии:
1.Инициация
2.Элонгация
3.Терминация
Инициация. Необходимые компоненты: Инициаторный белок, ДНК-хеликаза, ДНК-гираза, ДНК-стабилизирующий белок (SSBбелок), полный набор рибонуклеотидов, праймаза, АТФ.
Без SSB-белка^ |
ДНК-хеликаза расплетает |
образуются |
днк. |
«шпильки» /—-л. |
|
|
SSB-белкн |
|
препятствуют образованию |
|
водородных связей |
Инициаторный белок обнаруживает на молекуле ДНК точки на чала репликации и связывается с ними. Такие точки встречаются по всей длине молекулы ДНК. Для их функционирования необходима оп ределенная последовательность состоящая из 11 нуклеотидов ((А или Т) ТТТАТ (А или Г) ТТТ (А или Т)). Она получила название консен сусной последовательности. К инициаторному белку присоединяется ДНК-хеликаза. Этот фермент обладает АТФ-азной активностью. Он разрывает водородные связи между комплементарными нуклеотидами и расплетает ДНК. На разрыв водородных связей одной комплемен
|
тарной пары |
затрачивается |
По всей |
I Решгакацнонньи |
Реплнка- |
|
энергия 2 АТФ. К каждой из |
|
длине |
[глазки увеличи- |
ционный |
|
освободившихся цепей |
при |
возникают |
иваются и прев] |
пузырь |
|
соединяется |
SSB-белок. |
Он |
состоит |
|
Репятствует образованию во |
репликацн- |
/вдаются в рсштв- |
го 2-х реп- |
|
нные глазки |
' к анионные пузы |
ликацвон — |
|
дородных СВЯзей между разде- , |
_________ . |
ных вилок. |
|
|
|
|
ДНК |
ри. |
рад |
Имися цепями ДНК и в каждой отдельной цепи препятствует об- |
^ |
«шпилек». В результате по всей длине ДНК возникают, |
ликаци6 Репликайи°нные глазки, а затем ретикационные пузыри. Реп- °нный пузырь состоит из 2-х репликационных вилок.
Процесс репликации происходит в обеих репликационных вил ках, но имеет противоположное направление. Противоположность ца_ правленности синтеза обусловлена тем, что цепи ДНК антипараллельны. Иными словами, нуклеотиды 5’-конца одной цепи комплементарно спарены с нуклеотидами 3’-конца другой цепи. А направление синтеза ДНК всегда одинаково —от 5’- к 3’-концу. В процессе расплетения
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Направление вращения |
ДНК-гираза разрывает |
|
|
ДНК перед ДНК-хеликазой |
цепь ДНК и вращает ее. |
Направление |
\Г |
|
ff/^П ослеустранения |
^ А /\A,n/Y |
раскручива- |
А |
у% 1j/Vlrifvвращения |
\у увi|i |
ння — ^ |
|
Iп1шУА(---- V П1 |
ЛКI111IДНК-гираза |
Д ДА Mr |
да* |
j ШЩМ |
/ |
\г’\/\.СПП1ВаетР^5©рв*™уго |
/ |
1 |
и |
вокруг целой цепи как V |
цепь ДНК |
|
ДНК-хелнхяза |
на шарнире в противоположном направлении. |
|
ДНК перед ДНК-хеликазой возникает очень быстрое вращение ДНК. Это вращение способно в значительной степени затруднить реплика цию и даже вызвать повреждения в структуре ДНК и ядре. Данное вращение устраняется ферментом ДНК-гиразой. Он обратимо разрыва ет одну цепь ДНК и обеспечивает ее вращение вокруг второй (целой) цепи как на шарнире. У эукариот ДНК-гираза не обнаружена. Вместо нее исйользуются ферменты топокзомераза-I и топоизомераза-П. То- поизомераза-I подобна ДНК-гиразе. Топоизомераза-П способна осуще ствлять разрыв 2-х цепей ДНК, проводя в разрыв другую двойную спираль ДНК и затем восстанавливать целостность разорванных цепей. Таким образом, этот фермент препятствует спутыванию реплицирую щейся молекулы ДНК.
Стадия инициации завершается синтезом короткого полирибонуклеотидного фрагмента (около 10 рибонуклеотидов) - п р а й м ер а - Синтез осуществляется комплементарно материнской цепи ДНК феР" ментом праймаза.
Элонгация. К З’-ОН группе праймера присоединяется ДНК- полимераза-Ш и осуществляет синтез дочерней цепи ДНК в на
правлении |
5’-» 3 \ Фермент не |
способен |
синтезировать дочер |
нюю цепь ДНК на «пустом» месте. Эта особенность обусловлена тем, что перед присоединением очередного комплементарного нуклеотида ДНК-полимераза-Ш проверяет правильность встраива ния предыдущего. Поскольку пре дыдущий нуклеотид отсутствует —
то и последующий не может быть присоединен. Поэтому для работы ДНК-полимеразы-Ш необходим праймер (затравка). Если направление синтеза дочерней цепи ДНК и направление движения репликационной вилки совпадают, то цепь синтезируется непрерывно и называется ли дирующей. Напротив, если направление синтеза ДНК и движения реп ликационной вилки не совпадают —цепь синтезируется фрагментами и называется запаздывающей. Фрагменты, образующиеся в запаздываю щей цепи, называют фрагментами Оказаки. Образование фрагментов Оказаки обусловлено необходимостью синтеза праймера каждый раз по мере продвижения репликационной вилки и обеспечивает так же увеличение скорости репликации ДНК.
Праймер необходим лишь для присоединения ДНК-полимеразы- III. После завершения синтеза фрагмента Оказаки праймер становится не нужным. Он опознается ДНК-полимеразой-1 и последовательно, нуклеотид за нуклеотидом, удаляется. Вместо удаленных рибонуклеотидов встраиваются комплементарные материнской цепи ДНК дезоксирибонуклеотиды. При этом для присоединения ДНК-полимеразы-1 используется З’-ОН группа предыдущего фрагмента Оказаки (или ли дирующей цепи). Сшивание синтезированных фрагментов ДНК в одну Цепь осуществляется ферментом ДНК-лигазой.
Терминация. На данной стадии происходит слияние всех репликационных пузырей, молекулы дочерней цепи ДНК сшиваются ДНКлигазой, матрица исчерпывается, и процесс репликации прекращается.
У эукариот вместо ферментов ДНК-полимераза-I и III обнаружеНы ДНК-полимеразы а, (3, у и а. ДНК-полимераза а реплицирует ДНК 8 ядре клетки, р —необходима для репарации ДНК, у —реплицирует кольцевую ДНК митохондрий, а - похожа на а, однако, функция не известна.
1.3. Механизмы, обеспечивающие точность сборки дочерней цепи ДНК
Точность копирования ДНК очень высока. В среднем при копи ровании возникает 1 ошибка на 1х109 пар оснований (геном млекопи тающих составляет Зх109 пар оснований). Точность сборки обеспечи вается рядом механизмов, которые взаимно дополняют друг друга. Первым можно назвать способность ДНК-полимеразы-Ш проверять правильность встраивания нуклеотидов и, при необходимости, устра нять возникшие нарушения.
|
Неправильное |
|
|
К |
присоединение |
|
присоединение |
Ц |
ДНК -полимераза |
. |
АТ Г |
З’-ОН +Ц |
ATT |
Д Н вырезает часть цепи АТГ |
к ОН |
4-т |
n r |
i ■ -- |
■ ■И ■ И ■ |
/........................а п |
. |
|
|
4 |
ТА Ц |
А А А |
Т А Ц |
А А |
А для образования сво- |
Т АДА А А комплемен - |
|
|
|
|
водного спаренного • |
|
тарного |
|
|
|
|
З’-ОН-конца. |
|
нуклеотида |
ДНК-полимераза способна наращивать нуклеотидную последо вательность, присоединяя нуклеотиды только к спаренному З’-ОН- концу. Если происходит присоединение не комплементарного нуклео тида, то не образуется спаренный З’-ОН-конец и, следовательно, ДНКполимераза не может присоединить очередной нуклеотид. Активиру ется 3’-5’-экзонуклеазная активность, что и приводит к удалению не правильно присоединенного нуклеотида и восстановлению способно сти ДНК-полимеразы удлинять цепочку ДНК.
При синтезе праймера предпочтение отдается рибонуклеотидам,
'а не дезоксирибонуклеотидам. Это также обеспечивает увеличение точности сборки ДНК. Для действия ДНК-полимеразы необходим спа ренный З’-ОН-конец. Для этого синтезируется затравка (праймер). Правильность встраивания нуклеотидов затравки не контролируется. Если бы затравка синтезировалась из дезоксирибонуклеотидов, то при возникновении ошибок спаривания - они не смогли бы быть обнару женными. Поскольку затравка синтезируется из рибонуклеотидов - то
ДНК-полимераза I опознает их как неправильные и замещает на дезоксирибонуклеотиды. Таким образом устраняется вероятность соверше ния ошибки при построении праймера.
1.4.Повреждения ДНК и ее репарация
Вживых системах ежеминутно происходит нарушение структу ры молекулы ДНК. Наиболее часто встречаются следующие наруше
ния:
цепь ДНК
апуринизованын HiCT^Lo нуклеотид
КО - ЯН
НО—Р = о '
щепь ДНК '' цепь ДНК Апуринизация
- апуринизация (каждая клетка человека теряет за сутки около 5000 пуриновых оснований вследствие термального разрыва N- гликозидных связей между пурином и дезоксирибозой):
О
цепь ДНК |
НО—Р(—о |
цепь ДНК |
|
Дезамвпированве |
-Дезаминирование цитозина в урацил (до 100 нуклеотидов на 1 геном в сутки).
Воздействие ультрафиолетового света может привести к образованию
тиминовых димеров:
Это лишь наиболее часто встре чающиеся нарушения. Существует и значительное количество других нару шений. Большинство из них должно бы-
шз бы привести к выпадению нескольких пар оснований дочерней цепи ДНК после репликации или замене пары оснований. Например, каждое Дезаминирование Ц—>У должно было бы вызвать замены пары Ц-Г на
Г-А. Такие замены, если бы они не восстанавливались, могли бы при. водить к очень серьезным нарушениям в жизнедеятельности организ ма. Большая часть этих повреждений носит временный характер, по скольку они устраняются с помощью механизма, называемого репара цией ДНК. Если этот механизм не срабатывает, то изменения закреп ляются. Подобные изменения называют мутацией. Восстановление структуры ДНК возможно только при условии сохранности компле ментарного участка второй цепи ДНК.
Основной путь репарации включает 3 этапа:
Пэтап
ДН К -аолгакраи
Комплементарное
заполнение
«бреши»
|
1-этап |
|
|
|
распознавание н вырезание поврежденного |
повреждение |
участка (ДНК-репарирующне нуклеазы). |
ш М М М |
Ш Ш Ш |
- шт |
g |
|
Ш этап |
|
|
|
ДНК-лнгаза |
|
|
|
«сшивание» цепи |
|
|
|
|
1 1 1 |
|
1.Измененный участок ДНК распознается и удаляется при по мощи ферментов ДНК-репарирующих нуклеаз. Каждый из этих фер ментов распознает какой-либо 1 тип повреждения и устраняет его.
2.ДНК-полимераза связывается с З’-концом поврежденной цепи
ДНК и заполняет брешь, присоединяя нуклеотиды друг за другом ком плементарно уцелевшей цепи.
3. ДНК-лигаза сшивает ДНК и, тем самым, завершает восстанов ление структуры ДНК.
Некоторые особенности структуры ДНК облегчают ее репара цию. В ДНК, в отличие от РНК, урацил заменен тимином. Репарацион ная система ДНК обладает механизмом способным распознавать и удалять продукты спонтанного дезаминирования цитозина —т.е. ура цил. Если бы в состав ДНК входил урацил вместо тимина, то при рас познавании таких нарушений вырезались бы и нормальные участки. Замена урацила на тимин позволяет избежать таких осложнений.
Важность репарации можно подчеркнуть следующим примером. У больных пигментной ксеродермой в клетках накапливаются пири мидиновые димеры. Это обусловлено нарушением процесса репара ции, в котором участвуют как минимум 7 различных генных продУк' тов. Результатом такого нарушения является развитие тяжелого пор»' жения кожи, включая рак.
Биосинтез РНК (транскрипция)
1. Структурно-функциональная организация транскриптона (оперона)
Участок ДНК, отвечающий за синтез белковой молекулы и яв ляющийся единицей транскрипции, называют транскриптоном (у эу кариот) или опероном (у прокариот). По функциональному признаку в опероне выделяют регуляторные и структурные области:
-Промотор - участок ДНК, к которому присоединяется РНКполимераза.
-Оператор — место связывания белка — репрессора. Белокрепрессор кодируется геном-регулятором, который располагается вне оперона.
-Структурные гены - участки ДНК, несущие информацию о структуре белка. Структурные гены неоднородны и включают в себя интроны - не содержащие информации о структуре белка и экзоны - кодирующие структуру белковой молекулы.
-Терминатор - последовательность нуклеотидов, сигнализи рующая о завершении транскрипции. Часто представлена рядом АТ-
последовательностей, которые у ряда прокариот распознаются р- белком.
Структура Lac-оперона
Такая структура оперона свойственна ДНК Е.СоИ. Он кодирует структуру фермента (3-галактозидазы, разрушающего лактозу до глю козы и галактозы. Поэтому он получил название Lac-оперона.
Структура транскриптона лишь в функциональном отношении совпадает со структурой оперона. Основные его компоненты могут от стоять друг от друга на значительном расстоянии. Например, у эукари от регуляторные белки связываются с участками ДНК, отстоящими от промотора на значительное расстояние. Выявлены участки, усиливаю щие транскрипцию —энхансеры (enhance —усиливать). Существуют последовательности, заставляющие молчать некоторые гены. Их называют сайленсерами (silence —заглушать).
Таким образом, структура транскриптона значительно бодее сложна, чем структура оперона.
2. Механизм транскрипции
Условно выделяют 3 стадии:
1.Инициации
2.Элонгации
3.Терминации
Процесс транскрипции осуществляется ферментом РНКполимеразой. У E.Coli РНК-полимераза состоит из 5 субъединиц: а2, р Р’, а и и. Считают, что Р’-субъединица участвует в связывании с мат рицей ДНК, Р-субъединица осуществляет удлинение цепочки РНК, а2субъединица принимает участие в выборе участка инициации транс крипции, сг-субъединица находит строго определенные последователь ности нуклеотидов в промоторе.
На стадии инициации ст-субъединица находит соответствующий промотор, и происходит присоединение всей молёкулы РНКполимеразы. После синтеза цепочки РНК примерно из 8 рибонуклеотидов о-субъединица отделяется от ферментативного комплекса и мо жет быть использована другой РНК-полимеразой. Оставшийся без о- субъединицы фермент называется кор-ферментом. У прокариот РНК-- полимеразы одного типа и лишь ст-субъединицы отличаются по строе нию в зависимости от того, какой промотор они находят.
На стадии элонгации кор-фермент осуществляет синтез РНК в направлении 5’-э З \
На "стадии терминации белковый р-фактор опознает термини рующие последовательности ДНК и прекращает полимеразную реак цию. Кор-фермент отделяется от цепи ДНК и может повторно исполь зоваться после присоединения ст-субъединицы.
У эукариот выделяют 4 класса РНК-полимераз (I, II, III и IV). РНК-полимераза-I синтезирует большие р-РНК, РНК-полимераза-И - и-РНК, РНК-полимераза-Ш- мяРНК и т-РНК. Однако, большая часть мяРНК синтезируется РНК-полимеразой-П. РНК-полимераза-IV транс крибирует геном митохондрий. Для опознавания промотора эукарио тические РНК-полимеразы используют ряд белков, называемых фак' торами транскрипции (TF).
2.1.Созревание РНК (процессинг)
Врезультате транскрипции переписывается нуклеотидная посл^ довательность оперона. Синтезированная молекула РНК является ко пией оперона и содержит информативные и неинформативные пос
|
-гельности. Такая молекула РНК не может быть использована по |
|
ячеНИЮ. Она называется предшественником РНК. Синтезируется 3 |
на3 |
предшественников: |
ТИ |
1) пре-иРНК (г-яРНК). |
2)пре-Трнк.
3)пре-м-яРНК.
Гигантская ялерная РНК Рибонуклеопротеиновые комплексы
' |
О |
>S™ |
JK комплементарно |
присоединяется к концам |
беинформативнькх участков^ f |
вы тягивает и вырезает их. |
Информативные учас'
информативных участков
ция:
Перенос в
^Циншип»
Информофе;
Процесс преобразования предшественников РНК называют про цессингом. Процессинг включает в себя 3 операции:
1.Вырезание неинформативных участков.
2.Сшивание информативных участков —сплайсинг (to splice — сращивать).
3.Модификация 5’ и З’-концов РНК.
Вырезание неинформативных участков РНК осуществляется рибонуклеопротеиновыми комплексами, в состав которых входят мяРНК.
Процессинг
мяРНК на 5’ и 3’-концах имеют нуклеотидные последовательно0X11комплементарные концевым последовательностям неинформативныхучастков. мяРНК служит матрицей, на которой неинформативный Участок вытягивается в виде петли, при этом концы экзонов сближаЮтсяПроисходит вырезание неинформативных участков и сшивание информативных участков лигазой.
Модификация 5’ и З’-концов осуществляется также в ядре клет- (2'У' ^’'Концу присоединяется олигонуклеотидная последовательность Метилированных нуклеотида), причем концевым является 7-
метилгуанозин. Эта последовательность носит название «кеш (колпа чок). К З’-концу строго определенной нуклеотидной последовательно сти фермент поли-А-полимераза присоединяет полиадениловую после довательность. Считают, что такое модифицирование молекулы и-РНК предотвращает ее разрушение экзонуклеазами. Кроме того, «кеп» при нимает участие в сборке рибосомы при синтезе белковой молекулы. После всех модификаций молекула РНК связывается с белком инфор- мофером с помощью поли-А-последовательности и переносится в ци тозоль.
Процессинг пре-рРНК (45S) происходит в ядрышке. Вначале ме тилируется около 100 нуклеотидов, затем рибонуклеазы расщепляют 45S РНК на фрагменты 18S 5,8S и 28S р-РНК. Гены, кодирующие 5S р- РНК, находятся совершенно в другом месте, и 5SpPHK синтезируется отдельно от 45S р-РНК. Образовавшиеся 5,85, 28S и 5S РНК включа ются в большую субъединицу рибосом. 18S р-РНК формируют малую субъединицу.
Пре-тРНК образуется в разных местах ДНК хромосом. В ходе процессинга могут образоваться 2 и более молекулы т-РНК. К т-РНК присоединяется З’-концевая тринуклеотидкая последовательность ЦЦА. Это акцепторный участок для присоединения соответствующей аминокислоты. Ряд оснований т-РНК специфически модифицируются (метилирование, дезаминирование, восстановление...). Они определя-. ют вторичную структуру молекулы.
Обратная транскрипция
Впервые предсказана в 1962 году Говардом Теминым и открыта в 1970 году Девидом Балтимором. Процесс переноса генетической ин формации с РНК на ДНК возможен благодаря ферменту обратная транскриптаза (ревертаза). Это необычная форма ДНК-полимеразы, способная использовать в качестве матрицы и ДНК и РНК. Фермент обладает двумя типами активности.
1) Полимеразной - способен синтезировать цепь ДНК на матрице РНК или на матрице ДНК.
2) Нуклеазной - способен разрушать РНК. Структура молекулы закодирована на молекуле вирусной РНК. Такие вирусы называют ретровирусами. К ним относятся такие вирусы как вирус саркомы Рау са, вирус СПИДа и др. Геном ретровируса невелик - около 8500 нук леотидов. В каждой вирусной частице содержится по 2 таких молеку лы. Кроме РНК ретровирус содержит обратную транскриптазу.
