Биохимия пособие Коновалова 2012

Антибиотики - ингибиторы синтеза нуклеиновых кислбт и белков

Многие из наиболее эффективных антибиотиков, применяемых в ^временной медицине, действуют через ингибирование биосинтеза белка в бактериальной клетке. Знания особенностей структуры бело- «синтезирующего аппарата у прокариот и эукариот позволили созда­ вать высокоэффективные препараты, действующие преимущественно на метаболизм прокариот. Избирательность действия этих препаратов позволяет применять их в больших концентрациях без риска вызвать токсический эффект у человека.

Антибиотики, эффективные только в отношении прокариот:

1)Тетрациклин —предотвращает связывание аминоацил-т-РНК

сA-участком рибосомы. Прекращается элонгация белковой молекулы.

2)Неомицин и стрептомицин - связываются с 30S субъедини­ цей рибосом и изменяет ее конформацию. На стадии инициации нару­ шается сборка рибосомы на и-РНК.

3)Левомицетин (хлорамфеникол) —связывается с 50S субъеди­ ницей рибосом и ингибирует фермент пептидилтрансферазу. Не обра­ зуется пептидная связь между аминокислотами и прекращается удли­ нение полипептидной цепи.

4)Эритромицин и олеандомицин - блокируют реакцию транслокации пептидил-т-РНК в P-участок рибосомы.

5)Рифампицин —ингибирует стадию инициации транскрипции, связываясь с ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Прекращается синтез и-РНК. Препарат активен также и в отношении вирусов.

Антибиотики, эффективные в отношении прокариот и эукари­

от.

1)Пуромицин - связывается с пептидил-т-РНК и вызывает преждевременное отделение полипептида от рибосомы.

2)Актиномицин Д —связывается с остатком дезоксигуанина в молекуле ДНК и блокирует перемещение РНК-полимеразы по молеку­ ле ДНК. Прекращается удлинение молекулы РНК.

Эффективны только в отношении эукариот.

1)Циклогексимид - прекращает реакцию транслокации на ри­

босомах.

2)Анизомицин - ингибирует пептидилтрансферазную реакцию на рибосомах.

Ив заключении можно указать еще одно вещество, не относя­ щееся к антибиотикам, однако, часто встречающееся в медицинской

Практике —яд бледной поганки - а-амашггин. Он избирательно инги­ бирует активность РНК-полимеразы II. В результате прекращается синтез и-РНК.

311

Все указанные вещества действуют на различных уровнях био синтеза белка.

На уровне транскрипции (биосинтез РНК):

1.Актиномицин Д.

2.Рифампицин.

3.Яд бледной поганки - а-аманитин. На различных стадиях трансляции:

1.Тетрациклин.

2.Стрептомицин и неомицин.

3.Левомицетин.

4.Эритромицин и олеандомицин.

5.Пуромицин.

6.Циклогексимид.

7.Анизомицин.

Лекция 32

МУТАЦИИ И ИХ РОЛЬ В ОНТОГЕНЕЗЕ. КАНЦЕРОГЕНЕЗ

Мутации и мутагены

Нерепарированные изменения последовательности нуклео­ тидов в молекуле ДНК называют мутациями.

ДНК выполняет 2 очень важные и, на первый взгляд, взаимоисклю­ чающие функции. Это хранение генетической информации и адапта­ ция к окружающей среде; Первая требует высокой степени консерва­ тизма, а вторая - обеспечивается изменением генетической информа­ ции. Однако если смотреть с позиции выживания вида, эти функции не противоречат, а взаимно дополняют друг друга. Шансы вида на долго­ временное существование могут возрастать вследствие изменений в его генетической конституции (появление новых положительных при­ знаков), а выживание каждой конкретной особи данного вида требует сохранения генетической информации (поскольку большинство изме­ нений генома вредны). Поддержание постоянства генетического мате­ риала обеспечивается высокоэффективными механизмами репарации ДНК. Если эти механизмы не срабатывают, то изменения генетическо­ го аппарата закрепляются и называются мутацией. Все мутации Ус' ловно могут быть разделены на точечные и распространенные. Первые затрагивают незначительные фрагменты генома, вторые имеют более значительную протяженность. Наиболее распространенные мутации

312

сводятся к замене пар оснований (замена одного пиримидина на дру- роЙназывается транзицией, а замена пурина на пиримидин или наобо- т называется трансверсией), делециям (выпадение одного или не­ скольких нуклеотидов) и вставкам (появление новых, не свойствен­ ных ранее данному участку ДНК, одного или нескольких нуклеоти­ дов)- Последние 2 типа мутаций также называют мутациями со сдвиг0м рамки считывания. Сдвиг рамки считывания обусловлен тем, что будет нарушен порядок считывания информации и, следовательно, из­ менен код считываемого белка. Неотъемлемой частью мутаций являет­ ся рекомбинация. С ее помощью части генома или даже целые гены могут перемещаться с одного участка молекулы ДНК на другой, обра­ зуя новые комбинации генов и давая начало новым белкам, обладаю­

щими совершенно новыми функциями.

Частота мутаций не высока —примерно одна случайная замена пары нуклеотидов из нескольких тысяч за 2 000000 лет. И даже при столь не высокой скорости мутирования в популяции из 10000 особей, каждая возможная нуклеотидная замена будет испробована около 50 раз. Если какая-либо из замен несет в себе преимущества, то она будет закреплена генетически в ходе естественного отбора. Однако, «точеч­ ная» замена нуклеотидов не столь эффективна в эволюционном плане. Значительная нагрузка, в этом отношении, приходится на генетиче­ скую рекомбинацию.

Спонтанные мутации встречаются не часто, однако их количест­ во может в значительной степени увеличиться под воздействием различных мутагенных факторов. Все мутагенные факторы условно можНо Разделить на 3 группы.

1.Химические.

2.Физические.

3.Биологические.

313

Химические. К наиболее сильным химическим мутагенам отц0 сятся алкилирующие агенты (вещества способные вводить различи ' углеводородные радикалы в молекулы органических соединений), Q *

ЛПЛПлКтчI тт^т>мптАГГт 1Т/\ ппЛ11шг/чпаХлпт/\плгР1Г л	11Л11 лг»лтп	к .	'
способны избирательно взаимодействовать с атомом азота в 7-ом по
ложении гуаниновых остатков. Алкилирование	гуанина	приводит

возникновению ошибок при спаривании комплементарных азотистых оснований. Наиболее мощные представители алкилирующих агентов это иприт и его аналоги. Еще одна часто встречающаяся группа алкилирующих агентов это нитрозамины. Нитрозамины могут образовы­ ваться при взаимодействии любого вторичного амина с азотистой ки­ слотой. Такая реакция может протекать и в желудке. Образующиеся при этом нитрозамины могут всасываться и оказывать токсичное дей­ ствие на различные ткани. Нитрозамины являются также сильными канцерогенными веществами. По этой причине употребление пищи богатой нитратами, йредставляет значительную опасность.

Физические. К этой группе мутагенов относятся высокоэнергетические излучения (ультрафиолетовое, рентгеновское). Наиболее час­ то встречаются 2 типа реакций повреждения ДНК с участием пиримидинов (пурины примерно в 10 раз менее чувствительны к облучению, чем пиримидины).

1. Фотогидратация (чаще для цитозина).

2. Фотодимеризация тимина.

О

Ежегодно промышленность выпускает более 500 новых химиче­ ских веществ, некоторые из них применяются в качестве лекарствен­ ных препаратов, и могут обладать мутагенной активностью. Многие мутагенные и канцерогенные вещества в обычных условиях могут не проявлять патологической активности. Однако в живых организмах они могут подвергаться химической модификации (чаще гидроксилирование в ходе микросомального окисления) и превращаться в химиче­ ские мутагены. Процесс получил название летальный синтез. УчитЫ"

314

вая, что человек все больше исключает механизмы естественного отg0pa, данная проблема становится все более актуальной.

Биологические. К данной группе относятся микроорганизмы, способные вызывать мутации. Реализация мутагенного действия может быть осуществлена через химические вещества, продуцируемые этими микроорганизмами (афлатоксины —канцерогены, продуцируемые As- pergilus flavus), либо через введение фрагментов своего генетического аппарата в геном хозяина (ряд ретровирусов).

Рак

Большинство раковых опухолей начинается с изменений после­ довательности нуклеотидов в клеточной ДНК. Однако единичной му­ тации в одной или нескольких клетках может быть недостаточно для развития опухоли. Иногда опухоль может развиваться без нарушений структуры ДНК как следствие наследуемых особенностей регуляции экспрессии генов. В целом, каждый конкретный случай рака нельзя целиком свести к какой-то одной причине. Рак, как правило, является результатом случайного совпадения в одной клетке нескольких неза­ висимых событий. Чаще всего возникновение опухоли наблюдается как эффект накопления (кумуляции). Поэтому развитие рака, как пра­ вило, является длительным процессом. Скорость развития рака зависит от 4 основных показателей:

1.Скорости мутирования или частоты возникновения мутаций.

2.Численности популяции мутировавших клеток.

3.Скорости размножения (среднее число поколений потомства в единицу времени).

4.Избирательного преимущества мутантной клетки, которое оценивается по числу выживших потомков, произведенных за единицу

времени, к такому же показателю для немутантной клетки. Избира­ тельное преимущество зависит от природы мутации и от условий ок­ ружающей среды. Существенное влияние на него оказывают особен­ ности генетического аппарата, регулирующего экспрессию генов.

1. Химический канцерогенез

Одной из наиболее распространенных причин опухолевого роста, в настоящее время, является химическое воздействие на клетку. Кан­ церогенными могут оказываться различные вещества. Некоторые из Цих действуют на клетки-мишени в своем неизменном виде, другие требуют преобразования в более активную форму (чаще всего гидроКсилирование ферментом цитохром-Р-450-оксидазой в ходе микросомального окисления). В настоящее время известно большое количество

315

L

канцерогенов с различными свойствами, однако, единственное свойст­ во которое их объединяет - это способность вызывать мутации. Опу­ холевый рост могут вызывать не только химические факторы, способ­ ные вызывать мутации. В ряде случаев опухоль развивается и без из­ менения последовательности нуклеотидов. Так, например, у мыщед

рак кожи		можно		Г	тор	Промотор
вызвать,	втирая		в
кожные		покровы				тс	________	РАК
химический		кан­					С >	РАК
цероген	(мутаген)			BSE
бензпирен.		Одно­						Нет раке
кратный	контакт		с			ИГ--->	ЯГТ~^>Нет с
канцерогеном не вы­
зывает	опухолевой					Время

трансформации, однако вызывает скрытые повреждения генома. В результате повторное

взаимодействие с веществом другой природы может привести к разви­ тию опухоли. Причем это второе вещество не вносит изменений в структуру генома. О канцерогене, в данном случае говорят, как об опу­ холевом инициаторе. А вещества, сами по себе не являющиеся канце­ рогенами, но вызывающие опухолевый рост после воздействия ини­ циатора называют опухолевыми промоторами. Из опухолевых промо­ торов наиболее изучены форболовые эфиры. Они способны искусст­ венно стимулировать активность протеинкиназы С и, тем самым, через фосфатидилинозитолъный механизм, вероятно, искусственно стимули­ ровать деление клеток (или задерживать клетки в состоянии продол­ жающегося деления). Отдельно от инициатора промотор не может стимулировать опухолевый рост. В местах воздействия инициатора на­ чинается рост доброкачественных новообразований —папиллом. Чем больше исходная доза инициатора тем больше количество папиллом. Промотор может активировать работу генов контролирующих проли­ феративную активность и, тем самым, активировать рост злокачест­ венной опухоли.

2.Онкогены. Протоонкогены и механизм их превращения

вонкогены. Онкогенные вирусы

Животные клетки требуют гораздо более сложных условий для своего роста и деления, чем клетки простейших. Если клетки позво­ ночных животных выращивать в стандартной искусственной культу­ ральной среде, полностью лишенной кровяной сыворотки, то они, в большинстве случаев перестанут расти и остановят свое деление. Ис­ следования показали, что незаменимыми компонентами сыворотки яв-

316

ддотся высокоспецифичные белки. Различным клеткам необходимы различные белки. Некоторые из таких белков непосредственно участвуют в стимуляции клеточного деления. Их называют факторами роста. В дополнение к факторам роста существуют факторы, тормо­ зящие пролиферативную активность, однако, они менее изучены. Су­ ществует ряд факторов осуществляющих регуляцию межклеточных взаимодействий - цитокины. Все эти вещества ряд исследователей рассматривают как «микроэндокринную систему», которая осуществ­ ляет регуляцию жизнедеятельности клеток. Все эти регуляторные бел­ ки кодируются определенными генами.

4 ‘акторы роста, напри; сер Громбощггарнын. Кодир >-

ется геном c-sis_____ |	Ц итоплазматическая мембрана
Рецепторы факторов роста.	Протеинкиназы,	ras-белкн,
Вапример, тромбоцитаpHorcf-pfiвязанные с мембраной, -		►например,
Кодируется геном erb В	например «С» кодиру­	H-ras
	ется геном src

L нтоплазматические протеинкиназы

Белкм клеточной пролиферации	Регуляторы транскрипции
	Например, fas.

При любой форме рака нарушаются процессы нормальной регу­ ляции роста и пролиферации клеток. Некоторые элементы механизма, Регулирующего клеточное деление, по-видимому, одинаковы во мно­ гих типах клеток. Пролиферация клеток может регулироваться либо через механизмы, заставляющие клетку начинать очередной цикл деЛения, или через механизмы, регулирующие вступление клетки на путь окончательной дифференцировки. И в первом и во втором случаях,

317

нормальные гены, регулирующие пролиферацию, можно разделить ца 2 группы. Продукты первых стимулируют пролиферацию, а продуКТЬ| вторых —ее подавляют. Соответственно существует 2 типа мутаций Первые приводят к увеличению активности «стимулирующего» гена Такой измененный ген получил название онкогена, а его нормальный аллель называют протоонкогеном. Мутации второго типа приводят к инактивации «инактивирующего» гена. Такой ген называют также опу­ холевым супрессорным геном. Существует достаточно большое коли­ чество механизмов превращения протоонкогена в онкоген или инакти­ вации супрессорного гена. Ген может измениться в результате точеч­ ной мутации, хромосомной транслокации или вставки подвижного ге­ нетического элемента, такого как ДНК ретровируса. Если указанные изменения произойдут в участках, кодирующих регуляторный белок, это может привести к продукции белка-регулятора пролиферации с аномально высокой активностью или белка-репрессора со сниженной или отсутствующей активностью. В случае, когда изменения произой­ дут в прилежащих регуляторных участках, может осуществляться ги- ' перэкспрессия гена и, соответственно, аномально высокая продукция нормального регуляторного белка. В ряде случаев аномальная репли­ кация хромосом может привести к амплификации (увеличение количе­ ства копий) гена, кодирующего регуляторные белки. Это может также привести к гиперпродукции регуляторного белка. Роль протоонкогенов в настоящее время интенсивно изучается. Продукты многих генов взаимодействуют между собой как компоненты сложной регуляторной сети. Одни протоонкогены кодируют факторы роста, другие - их ре­ цепторы, а также некоторые протеинкиназы, третьи -G -белки семейст­ ва ras или ядерные регуляторные белки. Например, мутации гена, ко­ дирующего тромбоцитарный фактор роста (c-sis), приводят к его ги­ перэкспрессии, в результате клетки получают возможность постоянно стимулировать свой рост, усиление экспрессии гена с-тус (кодируе­ мый им белок участвует в подготовке ядра к делению) способствует переходу клетки к неограниченному делению.

Кроме мутаций генов контроля пролиферации, к развитию опу­ холевого процесса может привести внедрение чужеродной ДНК, кото­ рая вводится в клетку вирусом и, через свои продукты, вмешивается в процесс контроля клеточного деления. Вирусы, способные вызывать опухолевый рост, получили название онкогенных вирусов. Ранее, во второй лекции, мы рассматривали механизм действия ретровирусовВнедренный в ДНК клетки-хозяина ген вируса может действовать как онкоген, вызывая опухолевую трансформацию. Однако, онкоген ви­ русного происхождения принципиально отличается от онкогенов са­ мой клетки, - у него нет гомолога в геноме нормальной клетки. Боль­ шинство ДНК-содержащих ретровирусов относительно безвредны ДлЯ

318

плетки-хозяина. Зараженная клетка постоянно выделяет новые вирусHbie частицы и не вызывает опухолевой трансформации клетки. Однако иногда может происходить случайный захват ретровирусом регуля­ торного клеточного гена, его испорченной копии или части этого гена. ЗтЛ гены не используются самим вирусом, но могут кардинально из­ менять судьбу клетки-хозяина, приводя к ее опухолевой трансформа­ ции. Протоонкоген, включенный в состав ретровируса, может транс­ формироваться в онкоген двумя путями.

1.В результате изменения последовательности или фрагмента­ ции гена (в итоге синтезируется белок с аномальной активностью).

2.В результате попадания протоонкогена под контроль регуля­ торных систем самого вируса, что приводит к избыточному синтезу его продукта и созданию неподходящих условий для его функциони­ рования.

Еще один механизм может обеспечить опухолевую трансформа­

цию клетки. ДНК копии вирусной РНК могут встраиваться рядом с протоонкогенами или даже внутри их. Это может вызвать аномальную активацию нарушенного встраиванием гена. Такой механизм получил название вставочного (инсерционного) мутагенеза.

Полиморфизм белков

Как уже было сказано выше, мутации, с точки зрения эволюции, скорее полезны, чем вредны. При эффективно работающем механизме естественного отбора мутации позволяют приобретать новые полезные для выживания вида свойства, усложняют живую систему, позволяя ей наиболее адекватно приспособиться к условиям окружающей среды. Исключение естественного отбора ведет к накоплению негативных признаков в генетическом аппарате живых организмов. Анализ ДНК позволяет утверждать, что многие белки, в эволюционном плане, про­ исходят из одного гена, который в ходе эволюции дал ряд новых генов, кодирующих белки с новыми функциями. В результате возникли мно­ жественные формы одного и того же белка, предназначенного для вы­ полнения одной и той же функции с некоторыми отличиями для раз­ личных клеток и тканей. Например, у млекопитающих почти каждый ген представлен в нескольких вариантах: разные гены актина в различ­ ных типах сократительных клеток, разные гены родопсина для воспри­ ятия различных цветов, различные гены коллагена для различных та­ нов соединительной ткани. В качестве иллюстрации рассмотрим се­ мейство белков глобинов (гемоглобин). Ряд генов, кодирующих белки семейства глобинов, локализуются в различных местах, однако имеют единого эволюционного предшественника. Самая простая молекула, Переносящая кислород, обнаружена у насекомых, морских червей и

319

примитивных рыб. Молекула гемоглобина высших позвоночных у ^ . роена более сложно. По-видимому, около 500 миллионов лет назад в ходе эволюции высших рыб произошла серия мутаций и удвоений соответствующего гена. В результате образовались 2 незначительно от­ личающихся между собой гена. Они кодировали цепи а- и р-глобинов У современного человека молекула гемоглобина состоит из двух а- и двух P-цепей. Такая структура более эффективна, чем структура, со­ стоящая из одной цепи. Она позволяет переносить большее количество кислорода (за счет кооперативного эффекта). Гемоглобин, состоящий из двух а- и двух p-цепей (а2р2) в наибольшем количестве встречается у взрослого человека и поэтому называется гемоглобин A (Adult - взрослый).

Существует еще одна разновидность взрослого гемоглобина - гемоглобин-А2. Он состоит из двух а- и двух 5-цепей (а252). В организ­ ме взрослого человека он представлен в небольшом количестве и по­ этому получил название минорного гемоглобина.

В ходе дальнейшей эволюции мутации подвергся ген, кодирую­ щий P-цепь. Образовавшаяся новая цепь получила название у-цепи. Гемоглобин, состоящий из двух a-цепей и двух у-цепей (а2у2), имеет большее сродство к кислороду, чем обычный гемоглобин А. Этот тип гемоглобина преобладает у плода во внутриутробном периоде разви­ тия, он получил название гемоглобин F (fetal-плодный). Большее срод­ ство к кислороду позволяет ему переносить кислород из крови матери (низкое парциальное давление кислорода) к тканям плода.

Замена отрицательно заряженной глутаминовой кислоты в 6-ом положении p-цепи на гидрофобную аминокислоту валин привела к об­ разованию гемоглобина-S (a2S2). У такого гемоглобина на поверхности Р-субъединицы образуются так называемые «липкие концы». На по­ верхности дезоксигенированного гемоглобина существует участок, комплиментарный «липким концам» р-субъединицы. Этот участок прочно связывается с «липкими концами», в результате молекула гемо­ глобина полимеризуется и выпадает в осадок и деформирует эритро­ цит. Эритроцит приобретает серповидную форму и быстро лизирует.

Вообще известно несколько сотен мутантных форм гемоглобина. Патологические состояния, при которых мутация вызывает изменение биологической функции гемоглобина, называют гемоглобинопатиями. Другая аномалия гемоглобина, связанная с понижением скорости син­ теза его цепей получила название таласемии. В зависимости от того, синтез какой цепи нарушен, различают а- и р-таласемии.

Наряду с множественными формами гемоглобина существуют множественные формы и многих других белков.

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) —фермент, который обратимо ката­ лизирует реакцию преобразования пирувата в лактат. В организме че-

320