Биохимия пособие Коновалова 2012

Оброчка вируса	Обратная транскриптаза
j				^	клётка-гозяи н	\
капвцд	/ \ внедрение /	\	к	синтез	разрушение	^ к-ДНК \
	/ S*-------- /			ДНК	усной РНК	(Синтез второй

лепи;

Обратная \х

^кскриптаза

РНК вируса

РНК			#\ ,
вируса
Обратная			__
; транскриптаза			..--"'ядро
1 #	Синтет,вн русйых
I		/ белков
		'ч-7ЧС^1 Синтез
I {Белки		' | /	вирусной
! капсид		РНК'	-Р-НУ

(вновьтннтезнрованные) вйруса

Проникновение вируса внутрь клетки приводит к активации об­ ратной транскриптазы. Фермент синтезирует на вирусной РНК так на­ зываемую «комплементарную ДНК» (кДНК) - транскрипт. После этого молекула РНК разрушается и на кДНК синтезируется новая цепь ДНК. Образовавшаяся двухцепочечная молекула ДНК встраивается в геном клетки-хозяина. Транскрипция вирусной ДНК приводит к, синтезу ви­ русных белков. В результате вновь формируется вирусная частица. На этом цикл вирусной частицы может быть завершен. Однако ряд вирус­ ных белков могут вмешиваться в процесс клеточного деления. Проис­ ходит опухолевая трансформация клетки. Гены, кодирующие синтез таких белков, получили название —онкогенов. Изучение вирусных он­ когенов значительно приблизило нас к пониманию причин и природы рака и пониманию механизмов регуляции роста и деления клеток.

Лекция 31

БИОСИНТЕЗ БЕЛКОВ (ТРАНСЛЯЦИЯ)

В предыдущей лекции мы рассмотрели направления переноса ге­ нетической информации. Генетическая информация хранится в ДНК. В ходе транскрипции переносится на РНК и, наконец, с помощью специфических молекул адапторов (т-РНК), переносится на белок. Пе­ ренос генетической информации от РНК на белок получил название

тРа»сляции.

Генетическая информация записана в нуклеиновых кислотах с Помощью генетического кода.

301

Свойства генетического кода

1)Триплетность. Каждая аминокислота кодируется последова­ тельностью из 3 нуклеотидов. Минимальное количество нуклеотидов способное обеспечить кодирование 20 протеиногенных аминокислот -1

3.(42=16 - недостаточно, 43=64 - даже избыточно).

2)Вырожденность (избыточность) - одну и ту же аминокисло­ ту кодирует несколько триплетов. Первый и последний нуклеотиды триплета могут варьировать, средний всегда неизменен. Эту особен­ ность генетического кода можно расценить как защиту от возможных последствий повреждений генетического кода. Если бы каждая амино­ кислота кодировалась только одним кодоном, то его повреждение обя­ зательно вызвало бы нарушение структуры синтезируемого белка. На­ личие нескольких вариантов триплетов уменьшает вероятность таких нарушений.

3)Наличие инициирующих кодонов (АУГ и ГУГ). Они коди­

руют включение в- полипептидную цепь формилметионина у прокари-' от и метионина у эукариот.

4)Наличие терминирующих кодонов (УАА, УАГ, УГА). Они указывают место завершения синтеза полипептидной цепи и не коди­ руют аминокислот.

5)Неперекрываемость. Нуклеотид входящий в состав одного триплета не может входить в состав соседнего (при кодировании одно­ го белка).

6)Однонаправленность считывания. Направление считывания

информации всегда одинаково - 5’-»3\

7)Специфичность. Один триплет соответствует одной амино­ кислоте.

8)Универсальность. У всех живых организмов аминокислоты

кодируются одинаковым кодом. Исключение составляют 4 триплета в митохондриальной ДНК. Это, вероятно, обусловлено малым размером генома митохондрий. Поскольку изменения не затрагивали важных белковых структур, то они закреплены в кольцевом геноме. В ядре та­ кие изменения могли бы быть летальными.

9) Колинеарность. Соответствие последовательности аминокис­ лот в белке, последовательности кодонов в РНК.

Трансляция

1.Необходимые компоненты и их краткая характеристика

1)и-РНК.

2)полный набор т-РНК.

3)Рибосомы.

302

4)АТФ, ГТФ, ионы Mg++.

5)Ферменты аминоацил-т-РНК-синтетазы и пептидилтрансфе-

раза.

6) Ряд вспомогательных белковых факторов.

и-РНК. и-РНК прокариот и эукариот схожи. Однако есть и суще­ ственные отличия. У эукариот и-РНК имеет 5’-«кэп». Он состоит из 7- лггилгуанозина и двух метилированных по рибозе нуклеотидов. За ними следуют: инициаторный кодон АУГ или ГУГ (кодируют метио­ нин), структурные кодоны (кодируют последовательность аминокис­ лот в белке), терминальные кодоны (УАА, УАГ, УГА - останавливают трансляцию) и полиадениловая последовательность.

участок связывания		терминирующий
рибосомы
5’		кодон
M E T G { P ) @ 0 -		Г I стру»&ур(шле кодоны
«к^п»	иннцкаторныи кодов

Прокариотическая и-РНК не имеет 5’-«кэп» участка и полиадениловой последовательности. Инициаторным кодонам (АУГ), как пра­ вило, предшествуют специфические, шестинуклеотидные инициаторные последовательности.

У эукариот инициаторный комплекс, предшествующий сборке рибосомы, опознает именно 5’-«кэп» и следующий за ним инициатор­ ный кодон (АУГ), а затем присоединяется к ним. Ни один другой АУГ - кодон по ходу молекулы и-РНК не может быть местом начала синте­ за белка. Поэтому у эукариот синтезируется только 1 белок на основа­

нии 1 молекулы и-РНК.
У прокариот рибосома находит специ­
фические	шестинуклеотидные	последова­ 1. ! ААЦ У Ц А А Г А Ц
тельности	и начинает синтез белка с бли­		г.
			Последовательность 1:
жайшего инициаторного АУГ		кодона. По- асн-лей-лиз-асн~.
			Последовательность 2:
			лей-лнз-тре...

303

скольку таких последовательностей может быть несколько, то пропс, ходит так называемый сдвиг рамки считывания. В результате на осц0. ве одной молекулы и-РНК прокариот может синтезироваться несколь. ко различных белков. Значение полиадениловой последовательности достоверно не известно. Предполагают, что она обеспечивает связывание с белком информофером при переносе и-РНК в цитозоль, и, возможно, определяет количество молекул белка, которое может быть синтезировано на данной молекуле и-РНК.

Рибосомы. Перенос генетической ин­ формации от и-РНК к белку осуществляется с помощью рибосом. Значение их для синте­ за белка очень высоко. Именно рибосомы

определяют место начала считывания информации с и-РНК. Ошибка определения места считывания хотя бы на 1 нуклеотид приведет к сдвигу рамки считывания и синтезу совершенно иного белка. Именно рибосомы собирают вместе все компоненты синтеза белка и обеспечи­ вают продукцию белковой молекулы. Несколько рибосом могут одно­ временно считывать информацию с и-РНК, последовательно «садясь» на нее, такие комплексы называют полирибосомами (или полисомами). Полирибосомы, локализующиеся на эндоплазматическом ретикулуме, в основном синтезируют белки мембран и экспортные белки. Цито­ зольные полирибосомы обеспечивают синтез белков для нужд клетки.

Рибосомы прокариот по молекулярной массе меньше чем эука­ риот, и поэтому, при ультрацентрифугировании имеют различные кон­ станты седиментации (константы Сведберга S —70 и 80S соответст­ венно). Они состоят из больших и малых субъединиц. У прокариот 50S и 30S субъединицы, а у эукариот —60S и 40S. Несоответствие сумм констант Сведберга отдельных субъединиц и целых рибосом обуслов­ лено условиями ультрацентрифугирования (плотность растворов, объ­ ем частиц рибосом...). Соотношение р-РНК и белков у прокариот 2:1 (65% РНК и 35% белка) а у эукариот 1:1 (50% РНК и 50% белка), р- РНК эукариот синтезируется в ядрышке в виде предшественника 45S РНК, который затем расщепляется на 5S, 5,8S и 28S р-РНК. Отдельно синтезируется 5S р-РНК. Рибосомные белки синтезируются в цито­ плазме и поступают в ядрышко. Здесь образуются рибосомы. Мала* субъединица состоит из 18S р-РНК и 33 белков, большая - 5S, 5,8S, 28S р-РНК и 49 белков. У прокариот малая субъединица содержит 16S р-РНК и 21 белок, а большая —5S, 23S р-РНК и 34 белка.

2. Механизм трансляции

Процесс трансляции условно можно разделить на 5 стадий: 1. Активации аминокислот (образование аминоацил т-РНК).

304

2.Инициации синтеза полипептидной цепи.

3.Элонгации.

4.Терминации.

5.Посттрансляционной модификации.

Активация аминокислот. В синтезе белков участвуют 20 про­ теиногенных аминокислот. Перед использованием они должны акти­ вироваться. Для этого они объединяются с т-РНК, образуя активное цакроэргическое соединение - аминоацил-тРНК. Катализирует этот процесс аминоацил-тРНК-синтетаза. Для каждой из 20 протеиноген­ ных аминокислот существует свой специфический фермент, который способен проверять правильность присоединения аминокислоты к т- РНК. Если присоединилась неправильная аминокислота, то такая ами- ноацил-т-РНК разрушается. Редактирующая способности аминоацил-т- рНК-синтетазы достигается благодаря ее особого строения. Фермент имеет 4 центра связывания:

1.Для т-РНК.

2.Для АТФ.

3.Для аминокислоты.

4.Для воды (вода используется для гидролитического устране­ ния неправильно присоединенных аминокислот).

Синтез аминоацил-т-РНК осуществляется в 2 этапа: 1.

	NH2		NH2
			он
	NHj-CH-C-O—Р=0
	I	II	I
	и О		О
O'	+ !ЧН2—сн—СООН
	R
он	он		ОН он
АТФ		Аминоацнладенвлат

ш 2

R— сн
I
с=о
А / ОН	О	ОН
° —Р—О—С“	+ т-РНК
О
ОН ОН	R — С Н —N H 2
Амииоациладенилат	Аминоацил-т-РНК

305

Инициация синтеза полипептидной цепи. Необходимые ком­ поненты:

1. И-РНК.

2.Инициирующая аминоацил-т-РНК (формилметионин-т-РНК у прокариот и метионин-т-РНК у эукариот).

3.Малая и большая субъединицы рибосом.

Стадия инициации начинается с объединения IF3 и малой субъе­ диницы рибосом. IF3 необходима для опознавания на и-РНК иниции­ рующих кодонов (АУГ или ГУГ). В это же время инициирующая фор­ милметионин-т-РНК связывается с IF2 и ГТФ. Оба комплекса объеди­ няются. Образуется инициаторный комплекс. Инициаторный комплекс связывается с и-РНК с помощью фактора IF1. IF2 способствует объе­ динению большой и малой субъединиц рибосом. Процесс протекает с затратой энергии ГТФ. После объединения обеих субъединиц высво­ бождаются все инициирующие факторы, ГДФ и неорганический фос­ фат. Описанный процесс необходим для определения точного места начала синтеза белка. Ошибка даже в 1 нуклеотид приведет к сдвигу рамки считывания и синтезу совершенно другого белка.

Всобранной рибосоме имеются 2 участка:

1.A-участок (аминоацильный) —имеет сродство к аминоацил-т-

РНК;

2. P-участок (пептидильный) - имеет сродство к пептидил-т-РНК-

306

Стадия инициации завершается присоединением в Р-участке к кодону и-РНК формилметионин-т-РНК соответствующим антикодо­ ном. В А-учаетке находится следующий кодон и-РНК, и он свободен для присоединения соответствующей аминоацил-т-РНК.

Элонгация полипептндной цепи. Необходимые компоненты:

1.Полный набор аминоацил-т-РНК.

2.Фермент пептидилтрансфераза.

3.Факторы элонгации EF-T, EFg.

4.Ионы Mg1"" и ГТФ.

Элонгация начинается с присоединения аминоацил-т-РНК в А- участок рибосомы к комплементарному кодону и-РНК. Присоединение происходит с затратой энергии ГТФ и при участии фактора EFT. В ре­ зультате между кодоном и-РНК и антикодоном аминоацил-т-РНК об­ разуются водородные связи. Когда 2 аминокислоты оказываются ря­ дом, фермент пептидилтрансфераза образует между этими аминокис­ лотами пептидную связь. Пептидная связь образуется за счет макроэргической связи аминоацил-т-РНК. Образовавшийся дипептид силами гидрофобного взаимодействия связан с P-участком рибосомы, но, в то же время, он связан с т-РНК в A-участке. т-РНК присоединена водо­ родными связями к кодону и-РНК. Дипептид не имеет сродства к А- участку. При участии EFg фактора, с затратой энергии ГТФ происхо­ дит перемещение пептидил-т-РНК в P-участок. EFg обладает ГТФазной активностью, иными словами - является ГТФ-азой. В результате Рибосома делает 1 шаг по и-РНК, и в A-участке появляется новый коДон и-РНК. Перемещение пептида из A-участка в P-участок называют Щанслокацией. К поступившему в A-участок кодону и-РНК вновь, по

307

принципу комплементарное™ присоединяется соответствующая амд. ноацил-т-РНК и процесс повторяется снова. Повторы происходят д0 тех пор, пока в A-участок не придет один из терминирующих кодонов

Стадия терминации. Необходимые компоненты:

Особые цитоплазматические белки —факторы высвобождения (FR1, FR2).

Указанные факторы опознают терминирующие кодоны (не коди­ рующие аминоацил-т-РНК, нонсенс-кодоны). FR1 - опознает УДА и УАГ, FR2 —опознает УАА и УГА и связываются с ними. При этом они изменяют активность пептидилтрансферазы. Фермент приобретает пептидилэстеразную активность и присоединяет к пептидил-т-РНК не аминокислоту, а воду. В результате полипептидная цепь отделяется от т-РНК. Рибосома диссоциирует на большую и малую субъединицы.

Фермент деформилаза (у прокариот) отщепляет формильную группу у N-концевого (инициаторного) формилметионина. Часто и у прокариот и у эукариот отщепляется N-концевой метионин от синте­ зированного пептида. В дальнейшем синтезированная полипептидная цепь спонтанно приобретает вторичную структуру, ферментативными путями —третичную и если белок олигомерен, то приобретает и чет­ вертичную структуру.

Посттрансляционная модификация. На этой стадии происхо­ дит формирование белковой молекулы, пригодной для выполнения функции. Для этого может (не всегда) происходить химическая моди­ фикация белка: метилирование по аминогруппе лизина и аргинина, фосфорилирование по ОН-группе серина, окисление лизина, пролина, присоединение кофактора, осуществляться частичный протеолиз...

308

3. Регуляция биосинтеза белков

Регуляции подвержены практически все этапы синтеза белков. Метаболиты и гормоны через ряд посредников способны изменять ак­ тивность транскрипции; гормоны способны влиять на посттрансляционную модификацию белков через изменение активности ферментов легилаз и др., сами вновьсинтезированные белки могут активировать разрушение своих и-РНК...

В1966 году впервые были идентифицированы и выделены бел­ ки-репрессоры лактозного оперона (Lac-оперон). (Структура Lacоперона была рассмотрена в предыдущей лекции). Открытие белковрепрессоров послужило толчком к изучению деятельности Lac-оперона

ипозволило Жакобу и Моно сформулировать концепцию регулируе­ мого оперона.

Впроцессе регуляции участвуют 3 типа генов:

1)Ген оператор - связывается с белком репрессором и предот­ вращает транскрипцию.

2)Ген регулятор —кодирует структуру белка-репрессора и.

3)Структурные гены (кодируют р-галактозидазу - фермент, расщепляющий лактозу до глюкозы и галактозы, галактозидпермиазу — обеспечивает транспорт галактозидов из среды в клетку и тиогалакто- зил-ацетилтрансферазу).

Всостав оперона входят:

1)Промотор (к нему присоединяется РНК-полимераза).

2)Ген-оператор.

3)Структурные гены.

4) Терминирующая последовательность.

Если клетки E.Coli растут на среде, содержащей лактозу, то в них синтезируется фермент Р-галактозидаза. Если в среде вместо лактозы находится глюкоза, р-галактозидаза не синтезируется.

промотор Структурные гены

\ оп4
1	2	3
СЧИТЫВАНИЕ НЕ ПРОИСХОДИТ ^
	и с г б о е р о н Т Г е в р-галактоэидазы
РНК-полимераза		2. Ген галактозидпермиазы
		3. Ген тногалжктознд-
		ацетнл-трансферазы

Появление в культуральной среде лактозы (индуктор) стимулиРУвт синтез р-галактозидазы по следующему механизму:

309

репрессора	|
	4
Белок-репрес-
сор	Лактоза Конформация	белки
	белка-репрессора изменена. Ген оператор свободен.

Индуктор (лактоза) связывается с белком-репрессором и образу, ет прочный комплекс. Конформация белка-репрессора изменяется, и он отделяется от гена оператора. Одновременно индуцируется образо­ вание комплекса цикло-АМФ-связывающего белка (САР-белок _ catabolite activator protein) и цЗ’5’-АМФ. Образовавшийся комплекс связывается с промотором и активирует транскрипцию ДНК фермен­ том РНК-полимеразой. Синтезированная РНК подвергается процес­ сингу, и образуется 3 молекулы и-РНК, на основании которых синте­ зируются Р-галактозидаза, галактозидпермиаза и тиогалактозидацетилтрансфераза. Индукция синтеза этих белков получила название

позитивной регуляции.

После переваривания лактозы комплекс белок-репрессор - лак­ тоза разрушается. Конформация белка-репрессора меняется на исход­ ную и он присоединяется к гену-оператору. Такая регуляция получила название негативной.

В течение длительного времени оставалось неизвестным, можно ли применить эту модель контроля биосинтеза белка к клеткам эукари­ от. В настоящее время известно, что модель Жакоба и Моно лишь час­ тично применима для эукариот. Регуляция биосинтеза белка в клетках эукариот значительно сложнее. Это обусловлено более сложной орга­ низацией ДНК эукариот. В эукариотических клетках ДНК упакована в нуклеосомы, регуляторные белки часто связываются с участками, уда­ ленными от промоторов на значительные расстояния. У эукариот более обширны регуляторные зоны.

Ген-регулятор РНК-полимераза
	1	2	3	герминатор
		Ген-оператор блокирован, синтез РНК не идет.
		f - Белок-репрессор
разрушена	Конформация белка-репрессора восстановлена.

310