Работа №4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЛОУРИ

Работа №4 ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЛОУРИ

1.Какими методами можно определить концентрацию белка?

Концентрацию белка можно определить оптическими методами, азотометрическим и колориметрическим методами.

К оптическим относят:

-спектрофотометрические методы, оценивающие интенсивность поглощения белками УФ лучей в диапазоне около 200 нм и 260 нм. Степень УФЛ - поглощения пропорциональна концентрации белка;

-рефрактометрические методы основаны на способности растворов белков преломлять свет пропорционально их концентрации;

-нефелометрические методы основаны на способности растворов белков рассеивать свет пропорционально их концентрации;

-поляриметрические методы основаны на способности растворов белков вращать плоскость поляризованного света пропорционально их концентрации.

Азотометрический метод основан на определении содержания азота и пересчёте его на концентрацию белка (в белках 16% азота).

К колориметрическому методу относят качественную реакцию на белки (биуретовая реакция), метод Лоури, метод сорбции белками определенных красителей. Интенсивность определяется концентрацией белкового раствора.

Также разработаны другие методы, например, флюориметрические, поляриметрические, а также методы атомно-абсорбционной спектрофотометрии и аминокислотного анализа белка.

2.Что лежит в основе спектрофотометрического определения концентрации белка?

В основе метода лежит способность пептидных связей образовывать комплексные соединения с солями меди. В щелочной среде ионы Cu+2 образуют комплекс с пептидными связями, переходя в Cu+. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина (фосфомолибденовая кислота с фенолом), образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь, с максимумом адсорбции при 750 нм.

Ответ не верен. Спектрофотометрический метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет со средним максимумом поглощения при 280 нм. Таким образом, измерив величину оптической плотности при этой длине волны и используя коэффициент экстинкции для данного белка, можно рассчитать его количество. В ответе на следующий вопрос Вы этот метод упомянули.

3.От чего зависит коэффициент экстинкции белка?

Коэффициент молярной экстинкции является характеристикой того, насколько сильно вещество поглощает свет на заданной длине волны. Он может быть использован для определения концентрации белка в растворе при помощи спектрофотометра.

Коэффициент экстинкции белка на длине волны 280 нм зависит исключительно от числа остатков ароматических аминокислот, в частности, триптофана, и потому может быть предсказан исходя из аминокислотной последовательности.

4.Как учитываются примесные вещества (соли и пр.) в растворителе?

Влияние мешающих веществ может быть минимизировано путем разведения, обеспечивающего концентрацию испытуемого белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений. Для освобождения от катехоламинов, дающих окрашивание, белок осаждают трихлоруксусной кислотой.

Для того, чтобы нивелировать влияние не поглощающих в диапазоне измерения примесей, используют кювету сравнения, в которой присутствует растворитель, но отсутствует белок. Если используются колориметрические методы, то в контрольный образец вносится растворитель без белка в таком же объеме, как и в опытные и калибровочные образцы вносятся соответствующие растворы белка. Величину поглощения в кювете сравнения вычитают из величины поглощения опытного образца. Если в измеряемом растворе присутствуют детергенты (мочевина, гуанидин), то от них избавляются путем предварительного обессоливания образцов (см вопрос 5). Некоторые коммерческие наборы для определения концентрации белка содержат дополнительные добавки для нейтрализации небольших количеств детергента.

5.Для чего проводится гель-фильтрация перед определением концентрации белка, полученного с помощью ионообменной хроматографии в буферах, содержащих мочевину?

Для определения белка методом Лоури мешают примеси мочевины, меркаптоэтанола и аминов. Для измерения концентрации апобелков необходимо предварительно перевести его в раствор, не содержащие этих примесей с помощью гель-фильтрации (обессоливания).

Практическое задание.

1. Был построен калибровочный график

концентрация белка, г/л	ОD750
0	0
0,015	0,003
0,0325	0,005
0,065	0,02
0,125	0,04
0,25	0,09
0,5	0,18
1	0,34
1,36	0,43

2. Исходя из уравнения (у=0,3259х+0,0019) была рассчитана концентрация белка. Построен график зависимости оптической плотности от концентрации белка.

OD750	концентрация белка, г/л
0,25	0,763385
0,013	0,034154
0,004	0,006462
0,1	0,301846

График по вычисленным концентрациям белка строить было не нужно. Либо построить его вместе с калибровочным графикм, чтобы показать, что кривые накладываются друг на друга и расчет верный.