Работа №5 АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ПО МЕТОДУ ЛЭММЛИ

Работа №5 АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЫХ РАСТВОРОВ БЕЛКОВ ЭЛЕКТРОФОРЕЗОМ ПО МЕТОДУ ЛЭММЛИ

1.Что такое электрофорез? Какие преимущества дает проведение электрофореза на твердых подложках?

Электрофорез – это процесс разделения веществ в электрическом поле в соответствии с их электрическим зарядом.

Электрофорез можно проводить в растворе и с использованием различных носителей:

-на фильтровальной или хроматографической бумаге - сниженная конвекция, разделенные зоны можно зафиксировать и окрасить.

-на пленках из ацетата целлюлозы - быстрый, требует меньшего количества пробы для анализа. Низкая адсорбционная емкость помогает избежать появления “хвостов” на электрофореграмме. После окрашивания фон остается бесцветным. Пригодны для иммуноэлектрофореза.

-в крахмальном геле - первый носитель со свойствами молекулярного сита. Активно препятствует конвекции. Повышает разрешение.

-в агаровом и агарозном гелях - Удовлетворительная прозрачность, высокая пластичность (проще резать, удобнее красить и определять ферментативную активность прямо в геле), простота изготовления.

2.Как формируется полиакриламидный гель?

ПААГ формируют путем сополимеризации акриламида (создающего линейную “основу”) и N,N′-метиленбисакриламида (служащего для поперечных “сшивок” линейных цепей).

Процесс полимеризации инициируется персульфатом, (можно применять другие инициаторы, напр., рибофлавин и свет) и катализируется N,N,N′,N′-тетраметилэтилендиамином (TEMED). При разрыве связи О-О образуются два свободных радикала, каждый из которых стимулирует разрыв двойной связи и присоединение молекулы акриламида, образуя свободные радикалы. Каждый такой радикал, в свою очередь, вызывает разрыв двойной связи и присоединение следующей молекулы с образованием нового радикала, и т. д. Цепная реакция полимеризации идет до тех пор, пока два радикала, встретившись между собой, не образуют обычную ковалентную связь. По такому же механизму в растущую цепочку линейного полимера одной из своих концевых винильных групп может встроиться метиленбисакриламид. Если его второй конец встроится в состав другой линейной полимерной цепочки, то образуется «сшивка».

В результате полимеризации получаются гели ячеистой структуры, размеры пор в которых зависят от концентрации мономеров. Каждый второй углеродный атом линейной цепи содержит кислотную амидную группу, что обеспечивает гидрофильность полимера.

3.Из каких участков состоит приготовленный вами гель и для чего служит каждый из них?

Гель должен состоять из агарозной пробки, разделяющего геля, концентрирующего геля и лунок.

4.Как и для чего проводят электрофорез белков в денатурирующих условиях?

Когда требуется фракционировать белки исключительно по молекулярной массе, применяют ПААГ-электрофорез в денатурирующих условиях. Этот метод позволяет оценить количество полипептидов в белковой смеси, при его использовании достигается очень четкое разделение зон, но активность ферментов полностью или в значительной мере может быть утрачена из-за их денатурации. Денатурирующие условия создаются путем обработки пробы трехкратным избытком додецилсульфата натрия, сокращенно – ДСН.

ДСН также сообщает полипептидным цепочкам вне зависимости от их аминокислотного состава сильный отрицательный заряд, что позволяет разделять молекулы только по массе.

5.Как с помощью электрофореза можно определить молекулярную массу выделенных рекомбинантных белков?

Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью нескольких маркерных белков с известной молекулярной массой. Для калибровки гелей есть смеси из предварительно окрашенных и неокрашенных белков с точно известными молекулярными массами, смешанными для равномерного окрашивания. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буфером образца и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец. После проведения электрофореза и окрашивания геля измеряют пробег для каждой полосы белка от вершины геля. Вычисляют отношение расстояние пробега каждого белка к расстоянию пробега. Строят график зависимости молекулярных масс маркеров от полученных значений испытуемого образца. Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью метода линейной регрессии.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗАДАНИЕ К КОНТРОЛЬНОЙ РАБОТЕ №5

У Вас все массы занижены. Либо страдает точность при построении графика, либо точность измерения расстояния до линии финиша, либо и то, и другое. Очевидно, что белок на дорожке №1 не может быть 30 кДа, так как его банд находится выше полосы, соответствующей 30 кДа стандартных белков, по которым построен график. И банды белков на дорожках №3 и №5 находятся существенно выше стандартного белка с массой 10 кДа.

И работу лучше делать самостоятельно, а не копировать. Не знаю, кто у кого копирует, но с Натальей у вас расчеты идентичны до мелочей, правда, она прислала раньше.