Методы световой микроскопии

Обычные и стереоскопические микроскопы позволяют вести исследования по методу светлого поля: на светлом фоне наблюдается изображение контрастного неокрашенного или цветного объекта. Данный метод применяется наиболее широко.

Метод тёмного поля основан на эффекте, который достигается освещением объекта полым конусом света (применяют специальный конденсор). При этом контрастный светлый объект виден на тёмном фоне.

Метод фазового контраста предназначен для повышения контрастности неокрашенных объектов (микроорганизмов, растительных клеток). Данный метод, в отличие от метода тёмного поля (выявляет только контуры), позволяет рассматривать элементы внутренней структуры объекта, детально изучать особенности срезов тканей или живых клеток.

Метод исследования в поляризованном свете применяется для изучения анизотропных клеточных структур, которым характерна строгая молекулярная ориентация. К таковым относятся, например, внутриклеточные мембраны, нити веретена деления, миофибриллы, мерцательные реснички. В поле зрения поляризационного микроскопа они выглядят ярко светящимися на тёмном фоне.

Метод интерференционной микроскопии основан на разделении светового пучка на два: один проходит через объект, второй — мимо него. В результате первый пучок несколько запаздывает и при интерференции (наложение друг на друга) изменяется яркость световой волны. Вследствие резко выраженной разности оптических путей неокрашенный объект может выглядеть цветным.

Спомощью данного метода можно также рассчитать сухой вес объекта (в граммах) и толщину его структур. Интерференционная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты.

Метод исследования в свете люминесценции проводится с помощью микроскопа, на котором установлены особый осветитель, люминесцентные объективы и система специальных светофильтров. Этот метод основан на явлении, возникающем, когда при облучении некоторые вещества и микрообъекты сами начинают светиться в цветовой гамме всего (или большей части) видимого спектра (рис. 4).

Данный метод нашёл широкое применение при цитохимических исследованиях, позволяющих изучать поступление, передвижение, накопление и выделение различных веществ клетки. В медицинской микробиологии его применяют для выявления возбудителей туберкулеза, дифтерии, гонореи, возвратного тифа и др.; в онкологии — для цитодиагностики опухолей.

Электронная микроскопия

Первый электронный микроскоп сконструировал в 1934 г. немецкий учёный Э. Руска. Электронная микроскопия применяется с 1939 г. Это один из важнейших методов исследования структуры объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм).

Современные электронные микроскопы дают возможность получить изображения объектов при увеличениях, приближающихся к 1 000 000.

В электронной микроскопии построение изображения основывается на законах геометрической и волновой оптики, а также на теории электромагнитных полей. В данном случае «линзами» служат электромагнитные катушки. Магнитное поле, создаваемое витками катушки, по которой проходит ток, фокусирует пучок электронов так же, как стеклянная линза собирает световой пучок.

По принципу действия современные электронные микроскопы разделяются на просвечивающие и растровые (сканирующие). Первые позволяют изучать образцы в проходящих, а вторые — в рассеянных объектом электронах.

Устройство и принцип действия просвечивающего электронного микроскопа подобны таковым светового микроскопа: аналогом источника света является электронный прожектор (электронная пушка); имеются объективная и конденсорные «линзы»; камера с предметным столиком; проекционная система, которая соответствует окуляру, но передает изображение на люминесцентный экран или фотографическую пластинку. Такой аппарат весит несколько тонн и достигает в высоту 2,5–3 м (рис. 5).

Источником электронов служит раскаленная вольфрамовая нить (катод). Излучаемые электроны ускоряются сильным электрическим полем и, проходя через отверстие в аноде, собираются в узкий пучок. Система «катод–анод» называется электронным прожектором.

Далее электронный пучок проходит через систему конденсорных линз и фокусируется на образце, закреплённом в специальном держателе. Держатель можно перемещать вверх-вниз и вправо-влево.

Исследуемый образец находится в магнитном поле объективной линзы — самой важной линзы, которая в итоге определяет максимальное разрешение микроскопа. Эта линза направляет прошедший через образец поток электронов в систему проекционных линз, а последние — на люминесцентный экран или фотографическую пластинку.

В результате бомбардировки электронами фотопластинки или экрана, покрытого специальным флуоресцирующим составом, получается видимое увеличенное изображение.

При столкновении с веществом электроны в той или иной степени меняют траекторию движения. Электронный поток рассеивается даже воздухом, поэтому в колонне работающего электронного микроскопа поддерживается глубокий вакуум, а исследуемый объект должен иметь минимальную толщину.

Участки препарата с повышенной плотностью или увеличенной толщиной, местá расположения тяжёлых атомов сильно отклоняют электроны, и потому выглядят тёмными зонами на светлом фоне (метод светлого поля).

Однако электромагнитные поля можно отрегулировать так, чтобы в диафрагму объектива попадали только рассеянные электроны. Тогда образец выглядит светлым на тёмном фоне (метод тёмного поля).

Изображение можно наблюдать через присоединенный к прибору бинокулярный световой микроскоп, выводить на телевизионный экран или записывать на видеоленту. Если регистрация электронов производится на фотографической пластинке, то получают снимок объекта — электронограмму (рис. 6). Электронограммы можно ещё увеличить примерно в 10 раз без потери чёткости.

Рис. 6. Электронограммы: А — митохондрия (метод светлого поля), Б — участок кристы митохондрии (метод тёмного поля)

Электронный микроскоп сканирующего типа изобретён в 50-х годах ХХ века. Его магнитные линзы фокусируют испускаемые электроны в пучок очень маленького диаметра (всего несколько десятков нанометров), называемый электронным зòндом. Последний перемещается по объекту подобно лучу, обегающему экран радиолокатора, и за определённое время сканирует заданную площадь поверхности образца. В результате на экране возникает рельефное изображение сканируемой поверхности объекта. Такой режим работы микроскопа позволяет получать высококачественные объёмные электронограммы (рис. 7).

Основным недостатком электронной микроскопии является тот факт, что она не позволяет наблюдать живые объекты, поскольку исследуемый материал помещается в условия вакуума и подвергается радиационному повреждению (электронный поток представляет собой ионизирующее излучение).

Применение электронной микроскопии в биологии и медицине направлено на исследования таких объектов, которые невозможно обнаружить с помощью обычного светового микроскопа. Путём электронной микроскопии выявлены детали строения биологических мембран, митохондрий, эндоплазматической сети, рибосом и других органоидов клетки. Данный метод широко применяется для изучения тонкого строения про- и эукариотических клеток, вирусов, бактериофагов, прочих субмикроскопических объектов.

В области медико-биологических исследований современные электронные микроскопы позволяют получить изображение даже отдельных макромолекул биополимеров (нуклеиновых кислот, белков, полисахаридов). Тем самым они вносят огромный вклад в развитие современной медицины, дают возможность глубже вникнуть в сложную биологическую сущность человека.