- •Основы генной
- •На предыдущих лекциях мы научились
- •Библиотека (клонотека) фрагментов ДНК
- •Репрезентативность
- •Размер библиотеки, в которой любая часть генома представлена с вероятностью 99%
- •Этапы создания библиотеки ДНК
- •Упорядоченные библиотеки: матрицы случайных клонов
- •Полное и частичное (неполное) расщепление ДНК рестриктазами
- •построенные из неперекрывающихся и перекрывающихся фрагментов ДНК
- •Упорядоченные библиотеки:
- •Оценка качества библиотеки фрагментов ДНК
- •Консервация библиотеки фрагментов ДНК
- •Отбор нужных клонов из фаговых и бактериальных библиотек
- •Блоттинг нуклеиновых кислот
- •Гибридизация по Саузерну
- •Физическое картирование генома
- •Четыре типа генетических карт геномной ДНК
- •Две стратегии построения физических карт ДНК
- •Рестриктазное картирование ДНК с использованием 5’-концевой метки
- •Рестриктазное картирование ДНК с использованием двух рестриктаз
- •Физ. карта низкого разрешен ия
- •Флуоресцентная гибридизация in situ FISH – Fluorescent In Situ Hybridization
- •Физическое картирование YAC-ДНК с
- •Идентификация всех хромосом человека методом FISH
- •Хромосомные территории в интерфазных ядрах (многоцветная FISH)
- •Секвенирование ДНК по методу Сэнгера
- •Заполнение пробела между двумя контигами хромосомной ДНК: Прогулка по хромосоме
- •Исследование экспрессии генов на уровне транскрипции
- •«Северный» блоттинг (Northern blotting)
- •Быстрая амплификация 3’- концов мРНК: 3’-RACE
- •Быстрая амплификация 5’- концов мРНК: 5’-RACE
- •Дифференциальный дисплей (DD)
- •Анализ
- •Супрессия
- •Супрессорная вычитающая гибридизация
- •Обратный Северный блоттинг/Саузерн
- •Олигонуклеотидный биочип высокой плотности
- •Биочип с иммобилизованными кДНК
- •Схема сканирования ДНК-биочипа считывающим устройством
- •Олигонуклеотидный биочип после компьютерного псевдоокрашивания
- •Представление данных с помощью «тепловой карты» (heat map)
- •Исследование транскрипции с помощью биочипов
- •Выявление делеции длиной в 419 т.п.н. на хромосоме Xp21.1 человека с помощью биочипа
- •Дифференциальная экспрессия экзонов гена CD44 в метастазирующей опухоли
- •Иммунопреципитация хроматина: исследование на биочипах (ChIP-chip) и секвенированием ДНК (ChIP-seq)
Олигонуклеотидный биочип после компьютерного псевдоокрашивания
Соотношение
интенсивности флуоресценции в каждой точке от двух флуорофоров (красного и зеленого) позволяет представлять данные в виде оттенков зеленого и красного цвета
Представление данных с помощью «тепловой карты» (heat map)
Влияние глюкозамина (Gln) и интерлейкина
1β (IL-1beta) на транскрипцию исследуемых 100 генов в культивируемых клеткахКрасный. – повышенный уровень транскрипции Синий – пониженный уровень (абсолютные значения)
Гены сгруппированы по ответу на воздействие
(+) Gln и/или IL-1β
Гены – в строках, клетки – в столбцах
Исследование транскрипции с помощью биочипов
|
|
|
Количествен |
|
|
|
ный |
|
|
|
молекулярны |
|
|
|
|
|
|
|
й фенотип |
|
нет различий |
||
|
|||
|
клеток |
||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Транскрипция 4132 генов в |
Клетки |
клетках разных типов у человека. |
аденокарциномы, |
Выделены клетки эндотелия |
обработанные |
Выявление делеции длиной в 419 т.п.н. на хромосоме Xp21.1 человека с помощью биочипа Affimetrix SNP Array 6.0
Биочип содержит 1,8 млн маркеров, в том числе 900 000 зондов для индивидуальных SNP, равномерно
распределенных вдоль генома человека
Дифференциальная экспрессия экзонов гена CD44 в метастазирующей опухоли
(тепловая карта)
Биочип Affimetrix Exon 1.0 ST
Охвачен весь транскриптом человека:
в среднем:
4 зонда на каждый экзон и
40 зондов на каждый ген по двум цепям ДНК
Нормальный
сплайсинг
Пропуск
экзона
Пропуск экзона - Exon skipping
Иммунопреципитация хроматина: исследование на биочипах (ChIP-chip) и секвенированием ДНК (ChIP-seq)
Обратимое связывание белков с ДНК формальдегидом
Обогащение фрагментов ДНК с помощью специфических антител
Определение профилей ДНК с помощью биочипов (слева) или секвенированием (справа)