2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материал исследования.

Объектом настоящего исследования явились плаценты,полученные от 24 родильниц с неосложненным течением беременности, а так же 24 эмбриональных мешка на 10 – 15 сутки.

2.2.Методы исследования.

Основным методом в гистологических исследованиях является изучение окрашенных срезов различных тканей и органов.

Традиционный способ подготовки материала для получения постоянного гистологического препарата включал:

1)взятие материала и его фиксация;

2)уплотнение материала;

3)при­готовлен срезов;

4)окрашивание- или контрастирование срезов;

5)заклю­чение срезов в канадский бальзам или другие прозрачные среды (для световой микроскопии, которой мы и пользовалась).

I. Взятие материала для гистологического исследования производилось путем биопсии (от греч. bios - жизнь и opsis - зрение) - извлечения кусочка изучаемого органа (биоптата) из живого организма в целях прижизненной диагностики.

II. Фиксация небольших кусочков (0,5—1 см3) органов ( кусочков пилорического отдела желудка) в 10% формалине - 24 ч. Фиксация - это воздействие химическими или физическими агентами (фор­мальдегид, спирт, четырехокись осмия, замораживание и др.)

III. Заливка в парафин:

обезвоживание гастробиоплатов проводят спиртам возрастающей концентрации- 60°, 70°, 96°, 100°, 100° (в зависимости от характера материала от несколь­ких часов до I суток в каждом);

выдерживание в смеси равных частей 100° спирта и кси­лола -1,5-3 ч. В первом чистом ксилоле- 1,5-3 ч. Во втором чистом ксилоле- 1,5-3 ч. В насыщенном растворе парафина в ксилоле - 1,5-2 ч (в термостате при 37°). В первом чистом парафине - 1,5-2 ч (в термостате при 54-50°). Во втором парафине (содержащем 2-5% пчелиного воска) -1-1,5ч (в термостате 54-56°);

заливка материала парафином в бумажные или метал­лические формочки;

охлаждение в воде;

наклеивание на деревянные кубики и хранение на воз­духе.

IV. Приготовление срезов (парафиновых) производят с помощью специальных приборов — микротомов.

получение на микротоме срезов толщиной 5-7 мкм;

помещение срезов на предметные стекла в каплю дистиллированной воды и расправление их при легком подогревании на специальном столике (избыток воды убирается фильтроваль­ной бумагой); помещение предметных стекол со срезами на лотки и высушивание их в термостате при 37°.

V. Окрашивание парафиновых срезов гематоксилин-эозином

Окрашивание срезов позволяет выявлять разнообразные микрострукту­ры клеток и тканей, повышать их контрастность. Микроструктуры, отличаю­щиеся по своим физико-химическим свойствам, по-разному воспринимают красители, среди которых различают основные, кислые и нейтральные.

Основным красителем (в нашем случае ) послужил - гематоксилин, который связываясь с кислотными соединениями гистологических структур, вызывает их контрасти­рование окрашиванием в цвета синего. Структуры, воспринимающие основ­ные красители, называют базофильными.

Кислым красителем в данном случае явился эозин, он, связываясь с основными соединениями гистологи­ческих структур, вызывает их контрастирование окрашиванием в цвета кра­сителя (красного, розового.).

Интенсивность окраши­вания зависит от условий фиксации и количества прореагировавшего с кра­сителем вещества. Структуры, воспринимающие кислые красители, называют оксифильными.

А.Депарафинирование:

удаление парафина из срезов в трех порциях ксилола по 3—5 мни в каждом;

удаление из срезов ксилола с помощью 100° спирта -2—3 мин;

удаление из срезов спирта путем проведения по спиртам снижающихся крепостей — 96° и 70° по 2—3 мин в каждом и затем помещения в дистиллированную воду па 1—2 мим.

B. Окрашивание срезов:

Помещение среза в водный раствор гематоксилина — 2—3 мин;

» в водопроводную воду — 5—10 мни;

» в дистиллированную воду — 2—5 мим;

» в йодный раствор эозина — 0,5—1 мин;

» в дистиллированную воду — 0,5—1 мин.

VI. Обезвоживание срезов и заключение в бальзам. Заключение срезов позволяет длительное время сохранять препарат, его окраску, прозрачность и структуру. Полученные срезы заключались в канадский бальзам, предварительно произведя обезвоживание в спиртах возрастающей крепости.

Обезвоживание срезов в 70°,затем в 96° спиртах по 1-2 мин в каждом;

просветление срезов в ксилоле — 2 мин;

заключение срезов в бальзам;

помещение стекол со срезами на лотки для просушива­ния в термостате.

Срезы толщиной 5-7 мкм, окрашенные гематоксилин-эозином подверглись количественной оценке.

Методами линейных измерений при прямом микроскопическом исследовании измерительной линейкой при 280 кратном увеличении микроскопа, определяли меньший и больший диаметры поперечного сечения ядер децидуальных клеток базальной пластинки и септ. Используя полученные величины, вычисляли объемы децидуальных клеток их цитоплазмы и ядер, ядерно-цитоплазматическое отношение для них. В каждом препарате просматривалось 10 полей зрения в случайном порядке.

Для определения объемов клеток и ядер пользовались формулой Ташкэ : V = π/6 × LB², где L – больший диаметр ядра, В – меньший диаметр ядра.

Формула для определения объема цитоплазиы выглядит следущим образом: Vц = Vкл - Vя, где Vкл – объем клетки, Vя – объем ядра.

Выборочное среднее является той точкой, сумма отклонений всех рассматриваемых наблюдений от которой равна 0. Формула для выборочного среднего имеет вид: .

Стандартное отклонение отражает вариабельность в значениях данных и равно корню квадратному из выборочной дисперсии.

Стандартная ошибка среднего – отражает точность выборочного среднего.

Увеличение объема выборки приводит к снижению стандартной ошибки, что может увеличить точность исследования. Формула для её вычисления выглядит следующим образом: .

Техника приготовления и окраски препаратов детально описана в руководствах по гистохимии Э.Пирсом (1962) и гистологической технике Г.А.Меркуловым (1969).

Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) - отношение объемов ядра и цитоплазмы.Определяется по следующей формуле: ЯЦО=Vя\Vц. Позволяет оценить уровень метаболизма, выявить проявление компенсаторных реакций.

Сравнительная характеристика децидуальных клеток на разных сроках беременности проводится по нескольким критериям:

1)Клеточный объем (Vкл)

2)Ядерный объем(Vя)

3)Цитоплазматический объем(Vц)

4)ЯЦО

Статистическая обработка данных проводилась с использованием стандартного продукта «MS Excel». Полученные величины оценивались с вычислением среднего арифметического, ошибки среднего, стандартного отклонения, критерия Стьюдента ( t ), и показателя достоверности ( р ).