- •«Микроскопический метод исследования. Тинкториальные свойства и структура бактерий. Сложные методы окраски. Структура бактериальной клетки. Функциональные методы определения подвижности»
- •Микроскопия как основной и вспомогательный метод исследования в диагностике.
- •Простые методы окраски, техника, оценка.
- •Сложные дифференциальные методы окраски, их виды, назначение.
- •Метод Грама, как главный метод в дифференциации бактерий, его сущность, техника, оценка. Изучение тинкториальных свойств бактерий по методу грама
- •Оценка результатов. Грамположительные бактерии окрашены в темно-фиолетовый или синий цвет, грамотрицательные – в красный или розовый.
- •Метод Циль - Нильсена — способ окраски кислотоустойчивых бактерий окраска кислотоустойчивых микробов м. Tuberculosis методом циль – нильсена
- •Структура бактериальной клетки:
- •Окрасить мазок из дрожжеи по пешкову (выявление оболочки)
- •А) окраска нуклеоида бактерий ядротропным методом фельгена
- •А) выявление зёрен волютина по нейссеру
- •Б) выявление зёрен волютина простым методом леффлера
- •Временные структурные элементы бактериальной клетки (капсулы, споры):
- •Выявление капсул у бактерий методом бурри – гинса
- •Выявление спор у бактерии методом ожешко
- •Подвижность бактерий, их органы движения, способы выявления разными методами:
- •Выявление жгутиков у культуры подвижных микроорганизмов методом серебрения по морозову:
- •Функциональная оценка подвижности бактерий а) метод «раздавленной капли»
- •Б) метод «висячей капли»
- •1. Метод шукевича:
- •2. Метод посева в столбик полужидкой среды по пешкову:
- •Люминесцентная микроскопия - прямая.
Выявление спор у бактерии методом ожешко
Техника окраски:
На высушенный нефиксированный препарат (мазок готовится толстым и на краю стекла) наливают несколько капель 0,5% раствора хлористоводородной кислоты (HCl) и подогревают 1 - 2 мин над пламенем горелки/спиртовки до закипания, после чего остатки кислоты сливают.
Препарат (остывший) промывают водой, подсушивают и фиксируют над пламенем горелки/спиртовки.
Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании до появления паров.
Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение нескольких секунд.
Промывают водой.
Докрашивают 3 - 5 мин метиленовым синим Леффлера (дополнительный краситель), высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Оценка результатов. Споры бактерий окрашиваются в красный цвет, цитоплазма приобретает синий цвет, вегетативные тела микробных клеток – голубого цвета.
Подвижность бактерий, их органы движения, способы выявления разными методами:
а) окраска жгутиков по Морозову и Леффлеру, сущность, техника.
б) выявление подвижности бактерий функциональными методами:
- метод раздавленной капли;
- метод висячей капли;
- метод по Шукевичу;
- метод посева в столбиках полужидкого МПА.
- назначение оболочки, её строение, выявление по Пешкову; Ожешко, Бурри – Гинсу.
Выявление жгутиков у культуры подвижных микроорганизмов методом серебрения по морозову:
Техника окраски:
Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.
Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1 - 0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов переходит с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабо опалесцировать.
Приготовленную взвесь ставят на 1 - 2 ч в термостат при 370С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.
Затем в пробирку с 1,5 - 2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.
Капли высушивают на воздухе, не размазывая.
Для лучшего протравливания обрабатывают их реактивом № 1 (Реактив № 1: 1 мл ледяной уксусной кислоты. 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин.
Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.
После подсыхания мазка на препарат наливают реактив № 2 (Реактив № 2: 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды), подогревают на лёгком пламени до появления паров (1 мин).
Тщательно промывают водой (1-2 мин).
10) На подсушенный после промывания препарат наносят реактив № 3 (Реактив № 3: 5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется лёгкая опалесценция. Если аммиака будет слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции) и выдерживают его до появления тёмно- коричневой окраски мазка.
11) Тщательно промывают водой.
12) Высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.
Оценка результатов. Тела микробных клеток окрашиваются в коричневато-чёрный (угольно-черный) цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабо-желтый цвет фоне.