3.3. Зависимость интенсивности фотолюминесценции от концентрации люминесцирующих молекул. Люминесцентный анализ.

Как и спектрофотометрия, люминесцентный анализ решает качественную и количественную задачи.

Качественная задача решается на основании сопоставления спектров фотолюминесценции исследуемого образца с аналогичными спектрами выявляемого вещества в чистом виде. Следует заметить, что это сопоставление не всегда бывает просто реализовать, поскольку спектры фотолюминесценции в сравнении со спектрами поглощения при изменении окружения люминесцирующих молекул меняются гораздо сильнее. Поэтому не всегда спектр фотолюминесценции вещества в чистом виде совпадает с таковым в сложном объекте. Качественные критерии сопоставления спектров те же, что и при решении качественной задачи спектрофотометрическими методами.

Количественная задача на основании того факта, что интенсивность фотолюминесценции зависит от концентрации люминесцирующих молекул в образце. Выведем уравнение, описывающее эту зависимость.

По определению, квантовый выход фотолюминесценции есть:

(53)

q=(Число квантов фотолюминесценции)/(Число поглощенных квантов)

Число квантов фотолюминесценции, испускаемых с единицы поверхности образца за единицу времени есть интенсивность фотолюминесценции (J_фл). Если же на поверхность объекта падает возбуждающее монохроматическое излучение с интенсивностью J₀, а выходит из него непоглощенное излучение с интенсивностью J, то количество поглощаемых в полосе объекта толщиной l и с единичной площадью поверхности за единицу времени квантов составит J₀ – J. Подставим эти величины в выражение (53).

(54)

Исходя из уравнения (54) выразим J_фл в явном виде:

(55)

Кванты фотолюминесценции излучаются образцом во все стороны. Поэтому технически невозможно добиться того, чтобы все кванты фотолюминесценции регистрировались. Соответственно, в выражение (55) следует ввести поправку, которая показывает, какая часть всей флуоресценции образца регистрируется на данном приборе в данное время. Обозначим этот поправочный коэффициент k. Он носит название константа чувствительности прибора. После введения k в выражение (55), получим окончательный вид зависимости J_фл от концентрации (с) люминесцирующего вещества в образце:

(56)

Как видно из уравнения (56), зависимость J_фл=f(c) нелинейна. Однако, при небольших концентрациях исследуемого вещества, когда его оптическая плотность D0,1, выражение (1-10^-D) можно разложить в ряд Тейлора по степеням D, ограничившись 2-мя первыми членами:

Отсюда при D0,1:

(57)

Таким образом, если концентрация люминесцирующего вещества в образце невелика, а его оптическая плотность D0,1, зависимость между интенсивностью фотолюминесценции и концентрацией выявляемого соединения можно считать линейной. На практике, однако, не всегда бывает известна D люминесцирующего вещества в исследуемом объекте. Поэтому чаще всего для определения концентрации люминофора приходится в отдельном эксперименте строить зависимость J_фл=f(c) для данного соединения в чистом виде, в интервале концентраций, примерно соответствующих содержанию этого вещества в образце. Эта зависимость затем используется в качестве калибровочной. Следует, впрочем, заметить, что квантовый выход фотолюминесценции у люминофора в чистом виде и в составе сложного многокомпонентного образца не всегда одинаков.

Обратим также внимание на то, что в качестве коэффициента пропорциональности между J_фл и J₀ в выражении (56) выступает произведение kq(1-T). В этом произведении все три составляющих, k, q и (1-T), являются величинами меньше единицы. Поэтому J_фл всегда значительно меньше, чем J₀. Для регистрации J_фл требуются высокоинтенсивные источники возбуждающего излучения и высокочувствительные фотодетекторы. Поскольку регистрация слабых световых сигналов, таких, как фотолюминесценция, требует специального приборного обеспечения, остановимся подробнее на методах регистрации фотолюминесценции и приборах, позволяющих ее осуществить, подробнее.