3.6. Влияние окружения люминесцирующих молекул на параметры фотолюминесценции. Флуоресцентные зонды и метки.

Поскольку электронно-возбужденное состояние для молекул является термодинамически неустойчивым, возбужденные молекулы сильнее реагируют на изменения в окружении, чем невозбужденные. Наибольшее влияние на них оказывают такие показатели, как полярность близ расположенных молекул, их подвижность, диэлектрическая проницаемость среды.

Рассмотрим возможные сдвиги в характере фотолюминесценции при изменении диэлектрической проницаемости среды. Напомним, что относительная диэлектрическая проницаемость (будем здесь обозначать ее ) – физическая величина, показывающая, насколько сила взаимодействия двух единичных электрических зарядов в данной среде меньше, чем в вакууме. Относительная диэлектрическая проницаемость, по определению, величина безразмерная.

Каждая молекула в каждый конкретный момент времени является диполем (у которого «+» - суммарный заряд ядер, а «-» - суммарный заряд электронов). Как и любой другой диполь, молекула, таким образом, может быть охарактеризована величиной дипольного момента. Поскольку и ядра, и электроны в молекуле смещаются друг относительно друга из-за тепловых колебаний, величина дипольного момента молекулы во времени постоянно варьирует. Такие диполи принято называть осциллирующими. При электронном возбуждении среднее расстояние между электронами и ядрами в молекуле возрастает. Соответственно, значимо увеличивается и дипольный момент такой молекулы. Иными словами, возбужденная молекула – обычно более сильный диполь, чем невозбужденная. При пребывании в полярном растворителе такой диполь вызовет формирование вокруг себя слоя ориентированных соответствующим образом дипольных молекул растворителя. К чему это приводит, представлено на рис. 21.

Рисунок 21. Сдвиги в электронных энергетических уровнях молекулы при ее перемещении из неполярного (I) в полярный (II) растворитель. Пояснения в тексте.Публикуется с модификациями по: Рощупкин Д.И., Потапенко А.Я., Клебанов Г.И. Практикум по биофизике. Часть 1. Лабораторные работы по спектральным методам исследования и фотобиологии. М.: 1975, с. 21.

При помещении молекулы-диполя в полярный растворитель происходит взаимодействие дипольных моментов самой молекулы и дипольных моментов окружающих ее молекул растворителя. Обозначим величину дипольного момента у рассматриваемой молекулы в основном состоянии ⁰, а в возбужденном - ^. Пусть ^ будет больше ⁰. В ходе ориентации молекул растворителя и формирования вокруг растворенного молекул соединения сольватационных оболочек в этих молекулах происходит смещение вниз по величине энергии основного электронного уровня S⁰. Величина этого сдвига соответствует энергии сольватации Е₀. Изменяется и энергия возбужденного уровня S^. Однако сдвиг здесь происходит на другую величину (^>⁰) - Е^. Из-за различия в величинах Е₀ и Е^ происходит смещение частоты максимума поглощения рассматриваемых молекул:

После преобразований получаем, что величина сдвига частоты максимума поглощения (=h_a-h₀) при перемещении молекулы из неполярного растворителя в полярный составит:

Поскольку мы постулировали, что ^>⁰, в нашем случае Е^ будет больше Е₀. Соответственно, произойдет смещение максимума поглощения вещества в длинноволновую сторону.

При последующем испускании кванта фотолюминесценции излучательный переход происходит с нижнего из возможных колебательных подуровней молекулы люминофора (т.е. в неполярном растворителе квант будет испускаться при переходе S^ S⁰). Однако в полярном растворителе энергия уровня S^ будет снижена на величину Е^ и составит _рS^. В синглетно-возбужденном состоянии молекула-люминофор пребывает 10^-810^-9 секунды. Этого времени достаточно, для того, чтобы молекулы растворителя вокруг молекулы-люминофора успели переориентироваться. В результате энергия уровня _рS^ дополнительно падает на величину энергии сольватации W^, и становится равной ₁S^_р. Заметим, что это произойдет только в том случае, если время переориентации молекул растворителя значимо меньше времени жизни синлетно-возбужденных молекул-люминофоров. При низких температурах (менее 170^о К) это условие не выполняется, поэтому излучение кванта фотолюминесценции происходит с более энергонасыщенного уровня.

В обычных же условиях из-за более выраженного изменения энергии уровня S^ в полярном растворителе максимум в спектре фотолюминесценции смещается значительно сильнее, чем в спектре поглощения.

После излучения кванта фотолюминесценции молекула люминофора стабилизируется не сразу. Изначально ранее возбужденный электрон попадает на высший колебательный подуровень S⁰_р,к основного состояния. В ходе этого перехода дипольный момент молекулы снижается, однако переориентация молекул растворителя происходит позже. Соответственно, энергия сольватации в основном состоянии W^о оказывается меньше, чем энергия сольватации W^ в возбужденном. Далее начинается процесс переориентации молекул растворителя, сопровождающийся дальнейшим падением W^о. В результате энергия уровня S⁰_р,к нарастает, т.е. должно произойти дополнительное смещение спектра фотолюминесценции в длинноволновую сторону. В целом, величина смещения частоты максимума фотолюминесценции в полярном растворителе может быть описана следующей формулой:

Измеряя величину смещения полос в спектрах поглощения и фотолюминесценции молекул растворителях различной полярности, можно определить, насколько меняется дипольный момент этих молекул при возбуждении. Квантовая теория ориентационных взаимодействий молекулярных диполей дает следующую формулу:

(79)

В уравнении (79) _а – частота излучения в максимуме поглощения вещества; _ф – частота излучения в максимуме его фотолюминесценции; ^о и ^ - вектора дипольных моментов молекулы в основном и возбужденном состоянии, h - постоянная Планка; с - скорость света, l – радиус рассматриваемой молекулы-люминофора;  - относительная диэлектрическая проницаемость растворителя; n – его коэффициент преломления.

Расчет изменения дипольного момента вследствие электронного возбуждения по формуле (79) для триптофана дает величину =^-^о в 6 Дебай. Иными словами, полоса фотолюминесценции этого соединения смещается при изменении полярности окружения достаточно сильно. Поскольку во многих нативных белках остатки триптофана находятся в гидрофобных, относительно неполярных, частях молекул, вышеуказанное свойство позволяет применять измерение спектров фотолюминесценции триптофана (его остатков в полипептидной цепи изучаемого протеина) для исследования процесса денатурации белков.

Иногда в биологических образцах не удается зарегистрировать собственной фотолюминесценции содержащихся в них молекул-люминофоров. Причин этому может быть несколько, и мы рассмотрим некоторые из них ниже. Здесь же можно отметить, что в таких ситуациях в биологический объект специально вводят извне искусственные люминофорные молекулы, отличающиеся высоким квантовым выходом фотолюминесценции. Если введенный люминофор не присоединяется к какому-либо из компонентов объекта ковалентными связями, его принято обозначать, как флуоресцентный зонд. Если же люминофор ковалентно сшивается с молекулами образца, то это – флуоресцентная метка.

Как и у всех люминофоров, параметры фотолюминесценции у флуоресцентных зондов и меток меняются при изменении их окружения, что позволяет использовать данные соединения для изучения различных характеристик биологических объектов.

В качестве примера приведем значения спектрального положения максимума поглощения и фотолюминесценции для одного из флуоресцентных зондов, диметилхалкона (ДМХ, табл. 2).

Таблица 2. Спектральное положение максимумов поглощения и фотолюминесценции у флуоресцентного зонда диметилхалкона (ДМХ) в растворителях различной полярности.

Публикуется с модификациями по: Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. Физико-химические основы фотобиологических процессов. М.: «Дрофа», 2006, с. 45.

Структурная формула ДМХ:
Тип растворителя	Относительная диэлектрическая проницаемость растворителя 	Положение максимума поглощения, нм	Положение максимума фотолюминесценции, нм
Гептан	1,9	383	436
Толуол	2,4	402	472
Бутанол	17,7	418	545
Метанол	32,7	418	547
Вода	80	427	560

Следует заметить, что, поскольку от окружения молекулы-люминофора зависит не только спектральное положение максимума фотолюминесценции, но и квантовый выход этого вторичного свечения, с помощью флуоресцентных зондов можно анализировать достаточно сложные биологические процессы. Например, у так называемых Са²⁺-чувствительных флуоресцентных зондов (quin-2, fura-2, fura-3) квантовый выход фотолюминесценции возрастает на 2-3 порядка после связывания с молекулой зонда иона Са²⁺. Это обстоятельство позволяет с помощью подобных зондов регистрировать, в частности, кинетики изменения концентрации Са²⁺ в цитоплазме клеток в процессе физиологической активации в режиме реального времени.