Вирусология

2 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВИРУСОЛОГИИ

В вирусологической практике применяются следующие методы лабораторных исследований:

 Электронной и, в меньшей степени, световой микроскопии.

 Выделения и культивирования вирусов в культурах клеток (с выявлением их цитопатического действия, способности к гемадсорбции и других проявлений действия вирусов на клетки).

 Выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах и в организме чувствительных экспериментальных

животных.
ÏолесÃÓ
	Выявление вирусов по их гемагглютинирующей способности;
 Различные серологические методы исследования: традиционные
серологические		реакции		(реакция	связывания		комплемента,
преципитации в геле и др) и экспресс-методы; наибольшее значение
имеет	реакция		нейтрализации		вирусов		специфической
вируснейтрализующей сывороткой, которую проводят на различных
биологических объектах (культурах клеток, куриных эмбрионах, реже -
на животных)		целью идентификации виру ов, определения вирусных
антигенов или антител.
 Молекулярно-генетич ские м тоды и					ледования - молекулярная
гибридизация и полимеразная ц пная р акция.
Таким	образом,	в	вирусо огии прим няют			как	специальные
вирусологические		методы		исс дования,	так	и	общепринятые
микробиологические (граф			огической структуры 1).

Граф логической структуры 1 – Лабораторная диагностика вирусных инфекций человека и животных (по С.А. Павловичу)

11

2.1 Микроскопические методы исследования в вирусологии

2.1.1 Электронная микроскопия (ЭМ)

Электронноскопические препараты готовят из очищенных и концентрированных вируссодержащих взвесей или ультратонких срезов тканей, заражѐнных вирусами. Вирусные объекты наносят на специальные плѐнки-подложки, помещѐнные на опорные сеточки. Плѐнки-подложки должны быть очень тонкими (не более 30 нм толщины), прозрачными и достаточно прочными, например, коллоидийно-угольные. Плѐнки наносят на

поддерживающие сеточки из меди (диаметром 2-3 мм) с многочисленными отверстиями. Далее препараты обрабатывают различными способами:

контрастированиемÏолесÃÓяв яется наи учшим для изучения тонкого строения вирионов и изучения этап в взаимодействия вирусов с клеткой, но в то же время он наиб лее сл жен. Исследуемые кусочки инфицированной ткани или другого вирусс держащего материала фиксируют в специальном фиксаторе (например, осмиевом). Обезвоживают путѐм последовательного помещения в спирты возрастающей крепости. Заливают образцы пластмассой, после полимеризации которой образуются твѐрдые прозрачные блоки. Из блоков готовят ультратонкие срезы толщиной 10-20 нм на микротоме, Полученные срезы контрастируют, помещая в раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты.

 методы напыления металлами применяют для получения

контрастных препаратов. Пары тяжѐлых металлов (золота, платины, урана и др.), образующиеся в специальном приборе в условиях вакуума и высокой температуры, направляют под острым углом на виру одержащий препарат.

Вирусы оказываются покрытыми тонким лоем металла.

 метод негативного контра тирования о нован на том, что при обработке препарата некоторыми солями тяжѐлых металлов, например, 1- 2%-ным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, создаѐтся более

плотный слой,	не пропускающий эл ктроны,	а котором хорошо видны более
электроннопрозрачные исс еду мые объ кты.
 метод	ультрат нких срезов в	сочетании	негативным

Приготовленные вышеописанными способами препараты изучают в просвечивающем электронном микроскопе, разрешающая способность которого достигает 0,2-0,3 нм. Изображение препарата наблюдают на флюоресцирующем экране электронного микроскопа и фотографируют специальные фотопластинки, с которых получают отпечатки. Получаемые увеличения: ×100000-×400000 (рисунки 9 – 12).

12

ÏолесÃÓ
Рисунок 9 ― Вирус гриппа в культуре	Рисунок 10 – Вирус инфекционного
клеток через 12 ч после инфи-	ринотрахеита крупного рогатого скота:
цирования (иммунофлюоресцентная	ультратонкий срез, х 300000
микроскопия, ˟ 1200).
Видны светящиеся комплексы в ядре и на
внутренней поверхности плазмалеммы
Рисунок 11 – Аден вирусы	Рисунок 12 – Вирусы гепатита А

Сканирующая электр нная микроскопия осуществляется с помощью сканирующего электр нн го микроскопа, в котором тонкий пучок электронов быстро перемещается по исследуемому объекту, то есть сканирует его поверхность. В результате возникает излучение вторичных электронов, которое, проходя через катодно-лучевую трубку, преобразуется в объѐмное изображение объекта на флюоресцирующем экране. Сканирующая микроскопия позволяет получать трѐхмерное изображение вирионов (предварительно препарат напыляют металлами), различать детали строения их поверхности, но не выявляет их внутреннюю структуру. Разрешающая способность сканирующего микроскопа равна 7-20 нм.

2.1.2 Световая микроскопия

В пределах разрешающей способности микроскопа не менее 0,2 мкм можно увидеть крупные вирусы, в поражѐнных вирусом тканях внутриклеточные включения. Крупные вирусы (поксвирусы) и включения

13

обнаруживают с помощью специальных методов окраски, в фазовом контрасте, в тѐмном поле зрения и применяя люминесцентную микроскопию.

Внутриклеточные включения представлены скоплениями вирионов вперемешку с реактивными клеточными продуктами. Они находятся в цитоплазме или ядре клеток-хозяев. Цитоплазматические включения: тельца Гуарниери в эпителиальных клетках, скопления реовирусов и вирусов гриппа в них, тельца Бабеша-Негри – в нейроцитах. Ядерные включения: адено-, папова- и герпесвирусные. Изредка в одной и той же клетке наблюдаются цитоплазматические и ядерные включения (корь).

По форме, размерам, структуре, отношению к красителям вирусные вклю¬чения строго специфичны. Тельца Гуарниери имеют округлую, серповидную или амебоидную форму диаметром 1-10 мкм, тельца БабешаНегри – овальные или эллипсоидные, достигающие 20 мкм, включения реовирусов серповидные, наполовину охватывающие клеточное ядро

Тельца БабешаÏолесÃÓ-Негри по Туревичу окрашиваются в вишнево-красный цвет с черными зернами внутри, а цитоплазма нервных клеток, в которых они

(рисунок 8).

Техника окрашивания телец Бабеша-Негри и Гуарниери по Туревичу:

1.		Готовят препараты из срезов гиппокампа (при бешенстве) или
роговицы зараженного кролика (при пе).
2.		Окрашивают железным г маток илином – 2 мин.
3.		Промывают водой.
4.		Докрашивают 1%-м водным ра твором ки лого фуксина – 1 мин.
5.		Промывают водой.
6.		Обрабатывают смесью из равных частей насыщенного водного
раствора пикриновой кис оты и 95%-го спирта.
7.		Быстро пр мывают, высушивают.
8.		На неск лько секунд п гружают в абсолютный спирт.
9.	Высушивают и микр ск пируют.

находятся в светло-желтый. Тельца Гуарниери (рисунок 13) приобретают темно-синий цвет и тоже легко обнаруживаются на фоне более светлой цитоплазмы эпителия.

Рисунок 13 – Тельца Гуарниери (оспа)

14

Техника окрашивания телец Бабеша-Негри по Муромцеву:

1.	Из растертых в ступке кусочков гиппокампа делают обычные мазки.
2.	Фиксируют их метиловым спиртом или ацетоном – 1-2 ч.
3.	Промывают водой.
4.	Окрашивают разведенным 1 : 50 красителем Мансона (2 г

метиленового синего, 5 г буры и 100 мл дистиллированной воды), 5-10 мин.

5.	Переносят в 10%-й раствор танина до получения бледно-голубой
окраски.
6.	Промывают водой, высушивают.
7.	Обрабатывают абсолютным спиртом, несколько секунд высушивают и
микроскопируют.
			ÏолесÃÓ
	Тельца Бабеша-Негри (рисунок 14) по Муромцеву окрашиваются в
бледно-фиолетовый, а цитоплазма клеток - в синий.
Техника окрашивания мазков по Романовскому-Гимзе
1.	Мазок фиксируют в метиловом (5 мин), этиловом (10-15 мин) спиртах
или в смеси Никифорова (10-15 мин).
2.	Окрашивают смесью азур-эозин-метиленового инего (от 20-30 мин до
1 ч.).

Рисунок 14 – Тельца Бабеша-Негри:

1 – тельца Бабеша-Негри, 2 –эритроциты, 3 – нервные клетки

Ядра клеток окрашиваются в пурпурно-красный цвет, цитоплазма - в синий, а вирусные включения - в разные цвета и оттенки. В частности, тельца Бабеша-Негри - в красный, а Гуарниери - в пурпурно-красный, включения вируса гриппа - в синефиолетовый, а реовирусов - в фиолетовый.

Техника окрашивания мазков по Манну

1.Срезы окрашивают смесью 1% раствора метиленовой сини и 1% водного раствора эозина (24 ч).

2.Промывают в воде.

3.Обезвоживают в абсолютном спирте (срезы становятся синими).

15

4.Обрабатывают раствором (4 капли 1% раствора едкого натра и 50 мл

99,8% спирта).

5.После покраснения срезы ополаскивают в абсолютном спирте и затем

вводе.

6.Через 1—2 мин срезы помещают в слегка подкисленную уксусной кислотой воду, в которой они опять становятся синими.

Цитоплазма окрашивается в синий, хроматин — в тѐмно-синий, ядрышки и кровеносные сосуды — в красный цвета.

Для обнаружения телец Пашена (рисунок 15) и Арагана мазки подвергают «серебрению» по методу Морозова или обрабаты¬вают

вируснейтрализующим и антителами, мечеными флюоро¬хромами.

Техника «серебрения» по Морозову

1. готовят три раств ра:

N 1 - уксусно-ф рма ин вый фиксатор (100 мл дистиллированной воды , 1 мл ледяной уксусн й кисл ты, 2 мл 40% формалина);

N 2 - танин-фен л вая пр трава (10 мл дистиллированной воды, 5 г танина, 1 мл жидк го фен ла);

N 3 - адсорбент (свежеприготовленный 5%-й раствор нитрата серебра с добавлением нескольких капель аммиака, вызывающих легкую опалесценцию)

2. «Серебрение» мазков выполняется в три этапа промыванием после каждого из них водопроводной водой:

1) мазки фиксируются раствором N 1 – 1 мин;

ÏолесÃÓРисунок 15 – Т ьца Паш на (оспа)

2) протравливаются раствором N 2 с подогревом до отхождения паров;

3) «серебрятся» раствором N 3 с подогревом до появления темнокоричневого цвета

3. Мазки высушиваются.

Под иммерсионным микроскопом обнаруживают грозди кокковидных вирионов коричнево-черного цвета.

16

2.1.3 Люминесцентная микроскопия

Препараты, приготовленные из материалов, содержащих крупные вирусы, внутриклеточные включения, скопления вирусных антигенов, окрашивают растворами флюорохромных красителей. При люминесцентной микроскопии в УФ-свете окрашенные акридин-оранжевым скопления РНКгеномных вирусов и образуемые ими включения видны как светящиеся красные гранулы на фоне бледно-зелѐной цитоплазмы клеток; ДНКгеномные вирусы дают изумрудно-зелѐное свечение.

Иммунофлюоресцентный метод основан на соединении вирусов, внутриклеточных включений, скоплений вирусных антигенов со специфическими противовирусными антителами, меченными

1ДайтеÏолесÃÓопределение понятию «вирусы». Какие формы существования различают у вирусов? Какие размеры и форму имеют вирусные частицы?

2Какие свойства характеризуют виру ы как особое царство ультрамикроскопических организмов?

3Приведите примеры разных по морфологии виру ов. на

инфекций, в производстве вакцин, в проведении вирусологических исследований.

Работу с культурами клеток проводят в тщательно обработанной «вирусологической» посуде из специальных сортов стекла или пластиковой посуде из полистерола для одноразового использования (рисунок 16). Клетки должны постоянно находиться в сбалансированной физиологической среде,

17

содержащей все необходимые компоненты для их жизнедеятельности и размножения.

Приготовленную культуру клеток инкубируют в термостате при температуре 37,0-38,50С.

Питательные среды. Различают следующие питательные среды:

1. Естественные питательные реды (применяются редко),

готовят на основе солевых растворов Хенк а и Эрла, к которым добавляют сыворотку, амниотическую жидкость, эмбриональный экстракт. Например, среда для культивирования кл ток HeLa: ыворотка человека – 50%, куриный эмбриональный экстракт – 2%, раствор Х нк а – 48%.

2. Ферментативные гидролизаты б лковых веществ. В среды добавляют ферментативные гидро изаты: лактальбумина, казеина, белков крови крупного рогатого скота.

3. Синтетические питате ьные среды, которые отличаются сложным состав м, например, среда 199 (Паркера) содержит 20 аминокислот,17 витамин в, пурины и пиримидины, глюкозу, 9 минеральных солей и ряд других веществ, готовят на солевом растворе Хенкса, стерилизуют фильтр ванием через бактериальные фильтры. Среда Игла содержит 13 аминокислот, 4 катиона, 3 аниона, 6 витаминов, холин, инозит и углеводы.

Свойства питательных сред:

РисунокÏолесÃÓ16 – Лабораторная посуда для выращивания культур клеток

 наличие незаменимых аминокислот (таких, как глутамат, лейцин, изолейцин, валин, фенилаланин, аргинин, гистидин, метионин, треонин, цистин, тирозин), витаминов (особенно комплекса В), глюкозы и сыворотки крови;

 изотоничность и буферность среды, поддерживается с помощью неорганических солей (опт. рН 7,2-7,4), при длительном культивировании клеток 6,8-7,8. Постоянство рН в течение нескольких дней обеспечивается присутствием карбонатного и фосфатного буферов. Стабилизации значения рН способствует выращивание культур в пробирках и флаконах, закрытых резиновыми пробками, вследствие чего не улетучивается СО2 (в противном

18

случае это привело бы к сдвигу рН в щелочную сторону). Контроль за реакцией среды осуществляется путѐм добавления индикатора фенолрот: при рН 6,8-7,2 среда имеет жѐлтый цвет, при рН 7,2-7,4 – оранжево-розовый, при рН 7,4-7,6 – красный, при рН 7,7-7,8 – красно-фиолетовый.

 к солевым растворам и питательным средам нередко добавляют антибиотики, чтобы избежать бактериального и грибкового загрязнения. Применяют пенициллин и стрептомицин (по 60 000 ЕД/мл), тетрациклины, доксициклин, другие антибиотики широкого спектра действия в концентрации 0,1-0,01 мг/л; противогрибковые антибиотики – нистатин (20 ЕД/мл) и фунгизон.

 вода должна быть высокой степени очистки, рекомендуется применять бидистиллированную воду, перегнанную в стеклянных аппаратах

ТипыÏолесÃÓклеточных культур. Для приготовления культур клеток используют различные ткани животных, человека и птиц, как эмбриональные, так и зрелые. Кроме того используют и злокачественные перерождѐнные ткани, получаемые из опухолей. Источником эмбриональной ткани может служить куриный зародыш, эмбрионы человека, мышей, свиней, кроликов и др. Эмбриональная и опухолевая ткани отличаются лучшей выживаемостью и более активным ростом, чем ткани взрослого организма. Из зрелых тканей чаще всего употребляется почечная ткань (обезьян, морских свинок, хомячков и др.), амниотическая оболочка человека. Ткани

или очищенную в ионообменных колонках.

Питательные среды для клеточных культур в большинстве случаев готовят на основе солевых растворов, которые имеют состав солей, качественно и количественно приближающийся к составу жидкостей

животного организма (таблица 1).

Таблица 1

Состав основных сол вых ра творов (в г на )

Вещества	Раствор Х нк а	Раствор Эрла
NaCl	8,0	6,8
KCl	0,4	0,4
CaCl2	0,14	0,2
MgSO4×7H2O	0,1	0,1
MgSO4×6H2O	0,1
NaH2PO4×H2O	-	0,125
NaH2PO4×2H2O	0,06	-
KH2PO4	0,06	-
Глюкоза	1,0	1,0
Фенолрот (не всегда)	0,02	0,05
NaHCO3	0,35	2,2

19

берут в асептических условиях, промывают в солевом растворе Хенкса и затем подвергают измельчению.

В вирусологии используют только культуры растущих тканей, которые подразделяют на:

1.Культуры фиксированных кусочков тканей.

2.Однослойные культуры клеток:

а) первичные культуры клеток; б) перевиваемые (стабильные) культуры клеток; в) культуры диплоидных клеток.

3. Культуры суспензированных клеток (рисунок 17).

а - первичные типа фибробластов; 6 - п р вива мые типа HeLa; в - диплоидные

кл тки	гких ч лов ка
Первичные культуры к ток.	Источником являются эмбриональные

ткани птиц (обычно куриные фиброб асты), экспериментальных животных, обезьян, но чаще всего готовят их из трипсинизированных тканей абортированных 8-14-неде ьных п одов человека.

Техника получения первичн й культуры клеток:

1. Ткань пл да измельчают н жницами на мелкие кусочки (2-4 мм).

2. 2-3 раза тмывают т крови буферным раствором Хенкса до прозрачности жидкости.

3. Погружают кусочки ткани в подогретый (32-37°С) 0,25% раствор трипсина для разрушения межклеточного вещества.

4. На электромагнитной мешалке перемешивают взвесь (10-30 мин.). 5. Первую порцию трипсинизированных клеток удаляют.

ÏолесÃÓРисунок 17 – Моно лойные культуры клеток:

6. Для культивирования вирусов используют клетки от повторных трипсинизаций.

7. Фильтруют через марлю.

8. Центрифугируют при 800-1000 об/мин, 5 мин. 9. Надосадочную жидкость сливают.

10. Осадок отмывают раствором Хенкса.

11. Разводят средой 199 (или Игла), чтобы получить в 1 мл 100 000-400 000

20