Вирусология

клеток.

12.Взвесь клеток разливают по 1 мл в пробирки или по 20 – 100 мл в стеклянные матрацы, плотно закрывают резиновыми пробками.

13.Помещают в термостат (37 °С).

14.Матрацы располагают в горизонтальном положении, а пробирки – под углом 5-10° в специальных лотках. Прикрепляясь к стеклу, клетки в течение нескольких суток образуют монослой (рисунок 18).

РисунокÏолесÃÓ18 – Схема приготовл ния культуры клеток путем трипсинизапии

ткани:

1 - измельчение ткани; 2 - трипсинизация; 3 - фильтрование взвеси клеток; 4 - отсасывание раствора трипсина над осадком клеток;

5 - подсчет к еток в кам ре Горя ва; 6 - посев клеток в матрацы

Перевиваемые ку ьтуры к еток (линии клеток). Перевиваемые культуры клет к без пересева на свежую среду довольно быстро дегенерируют. П эт му исх дную ку ьтуру клеток выращивают в матрацах с питательной сред й, еженедельно пересевая культуру в новые сосуды. Пробирочные культуры также пересеваютих через 7-8 дней, или же раз в 3-4 дня заменяют питательную среду свежей, тогда клеточные культуры сохраняют свою жизнеспособность 2-3 недели.

Для культивирования перевиваемых культур клеток применяют среду 199 (часто добавлением 10% бычьей сыворотки), среду Игла с добавлением 20% сыворотки, 0,5% гидролизат лактальбумина, содержащий 5% телячьй сыворотки. Пример культур перевиваемых клеток: клетки, полученные из нормальных тканей: FL (из амниона человека), Rh (из почки человека), ВНК21 (из почки сибирского хомячка) и др.; из клеток злокачественных тканей: HeLa, Hep-1 (из шейки матки человека), Hep-2 (из гортани человека), J-96 (из лейкоцитов человека) и др.

Культуры диплоидных клеток (полуперевиваемые) выдерживают до 40-50 пассажей, проводимых на протяжении 8-10 месяцев, затем культура клеток дегенерирует и гибнет. Культуры диплоидных клеток получают из

21

различных тканей эмбриона человека, из первичных культур. Так, например, пользуется известностью штамм ДКЛЧ (диплоидные клетки лѐгких человека), штаммы WJT-38, JMR-90, MRC-5 из лѐгких ткани эмбриона человека. Диплоидные культуры служат для выделения и культивирования вирусов. Они чувствительны ко многим штаммам вирусов, онкогенно безопасны, пригодны для культивирования в промышленных масштабах и получения массового количества вирусных вакцин.

Суспензированная культура – это культура, в которой отдельные клетки или их конгломераты постоянно находятся во взвешенном состоянии

вжидкой среде. Они обладают большей активностью роста, накапливаются в

большом количестве, при регулярной замене среды длительное время остаются жизнеспособнымиÏолесÃÓ. Получают культивированием при постоянном интенсивном перемешивании среды путѐм вращения пробирок в барабане, с помощью магнитной мешалки, используют хемостаты для обеспечения автоматического обновления среды.

2.2.2Методы выделения и культивирования вирусов в развивающихся куриных эмбрионах

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут размножаться в курином эмбрионе. Плотная корлупа защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из вн шн й р ды. Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, д я изготов ния вирусных вакцин и диагностических препаратов. Недостатки метода: 1) н возможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса

втканях, в жидк стях эмбри на, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования

вкуриных эмбри нах приг ден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.

Строени куриного эмбриона. Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная

оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, она является органом выделения и защиты зародыша от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена

22

околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединѐн с желточным мешком – основным источником питательных веществ (рисунок

19).

РисунокÏолесÃÓ19 – Культивирование вирусов путем заражения развивающихся

куриных эмбрионов

Условия культивирования виру ов в организме развивающихся куриных эмбрионов: температурный режим (360-380С), влажность (50-70%), достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определѐнного возраста, инкубированные от 6 до 13 дн й в зави имо ти от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со ст ри ьным парафином, покровные стѐкла, пакетики стерильной ваты и мар и, завѐрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иг ы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спирт м, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.

Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

1) Заражение куриного эмбриона на хорион-аллантоисную оболочку применяют в случаях, когда вирус хорошо размножается в клетках этой оболочки (поксвирусы, герпесвирусы, вирус лейкоза кур и др.).Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста.

Этапы заражения:

23

1.Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2.Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3.в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.

4.Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см2).

5.Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путѐм

нанесения на неѐ 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью

осторожноÏолесÃÓизвлекают пинцет м и помещают в стерильную чашку с физиологическим раств р м, расправляют и изучают изменения, поместив

пастеровской пипетки или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плѐнкой

или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Заражѐнные эмбрионы помещают в термостат в вертикальном

положении и инкубируют в течение 2-3 суток
Правила вскрытия:
1.	Яйцо помещают на подставку воздушным пространством вверх,
стерилизуется место вскрытия.
2.	Стерильными ножницами р зают	корлупу	по	границе
воздушного пространства.
3.	Пинцетом снимают скор упную	оболочку	по	границе.

Обнажѐнную хориона антоисную оболочку подрезают вдоль края

скорлупы.
4.	Через браз вавшееся отверстие выливают всѐ содержимое яйца
в чашку или т к.
5.	Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку

чашку на тѐмный фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, еѐ нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют (2000 об/мин, 10-15 мин.), надосадочную жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.

2) Заражение в аллантоиную полость применяют при культивировании тех вирусов, которые размножаются в клетках эпителия (орто- и парамиксовирусы, герпесвирусы и др.). Вирус при этом поступает в аллантоисную жидкость, накапливаясь в ней в высоких концентрациях (например, вирус гриппа). Используют эмбрионы 10-11-дневного возраста. Этапы заражения:

24

1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.

4.	Отверстие в скорлупе заделывают расплавленным стерильным
парафином.
Заражѐнные эмбрионы выдерживают в термостате 2 суток. Перед
вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 40С.
Правила вскрытия:
1.	Яйцо устанавливается на подставке воздушным мешком вверх,
скорлупу над ним стерилизуют.
2.	Ножницами скорлупу срезают немного выше границы
воздушного пространства.
3.	Пинцетом осторожно удаляют скорлупную оболочку,

хорионаллантоисную оболочку прокалывают па теров кой пипеткой в том

месте, где нет сосудов, и насасывают аллантои ную жидкость.
4.	Аллантоисную жидкость п р но ят в терильную пробирку,				а
часть засевают в бульон для пров рки на бакт риологическую стерильность.
1.	Яйцо п мещают на подставку и проводят стерилизацию
скорлупы в области туп го к нца.
2.	Над центр м в здушного пространства в скорлупе ножницами
вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике.
3.	Осторожно снимают внутренний листок скорлупной оболочки с
помощью пинцета, обнажая подлежащую хорионаллантоисую оболочку.
4.	Прорезают	ножницами	небольшое	отверстие	в

хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и

вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и
	ÏолесÃÓ
вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной
оболочки.
5.	Удерживая амниотическую оболочку в этом положении,

производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-0,2 мл разведения вируса.

25

6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом, пользуясь для фиксации и герметизации яйца расплавленным парафином.

Заражѐнные эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток. Затем эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 40С.

Правила вскрытия:

1.	Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают
скорлупу немного выше края воздушного мешка.
2.	Прокалывают хорионаллантоисную	оболочку пастеровской
пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.
	ÏолесÃÓ
3.	Захватив пинцетом амниотический	мешок, прокалывают его

оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и насасывают амниотическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У заражѐнного эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем как у нормального эмбриона она прозрачна.

4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку. 0,1-0,3 мл засевают в бульон для контроля на бактериологиче кую стерильность.

4) Заражение в желточный м шок и пользуют для культивирования поксвирусов (вирусы гриппа, бол зни Ньюка ла, возбудитель орнитоза и др.).

2.2.3 Методы выде ения и ку ьтивирования вирусов в организме чувствительных эксперимента ьных животных

Лаборат рных жив тных испо ьзуют главным образом для выделения вирусов, не вызывающих видимых изменений в культуре клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах (вирус Коксаки А, возбудитель лимфоцитарн го х риоменингита, арбовирусы и др.).

Взятые в опыт животные должны быть одного вида, определѐнного возраста и содержаться в одинаковых условиях (таблица 2). Они обладают однотипной наследственностью, имеют минимальное число латентных инфекций.

Таблица 2 – Экспериментальные модели для некоторых вирусов

Наименование вируса		Экспериментальная модель
Вирус бешенства		Мыши, кролики
Вирус Коксаки		Мыши-сосунки
Вирус полиомиелита		Обезьяны, крысы
Вирус гриппа		Мыши, хорьки
Вирус клещевого энцефалита		Мыши
	26

Работу с животными рекомендуется проводить в настольном боксе или в специальной операционной вивария. При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражения.

Интраназальное заражение. Метод используют для выделения пневмотропных вирусов. Заражение мышей проводится под эфирным наркозом. Животных помещают в закрытую стеклянную банку, в которую положен кусок ваты, пропитанный эфиром. С помощью шприца или пастеровской пипетки в ноздри животного вводят 0,03-0,1 мл заражающего материала.ÏолесÃÓЗа животными устанавливается наблюдение, при проявлении признаков заболевания мышей забивают при помощи эфирного наркоза, а затем вскрывают.

Этапы вскрытия животных:

1. Увлажнѐнный 5% раствором лизола или фенола труп мыши фиксируют брюшком кверху на поверхности кюветы со смесью воска и парафина.

2. Обрабатывают кожные покровы пиртом, йодом и вновь спиртом; опаливают пламенем.

3. Ножницами делают продольный разр з кожи от нижней челюсти до лобка и боковые разрезы к лапкам, от паровывают еѐ.

4. Вскрывают грудную по ость, выр зав грудину ножницами по рѐберным хрящам.

5. Осматривают внешний вид органов грудной полости, обращая внимание на наличие экссудата. Изв екают лѐгкие при строгом соблюдении асептики и с храняют их при минусовой температуре в морозильнике до получения ответа на бактери л гический контроль-результат посева кусочка легочной ткани в мясо-пепт нный бульон (после выдерживания его в термостате при 370С в течение суток).

6. При отрицательном контроле на бактериальную загрязнѐнность готовят 10% суспензию легочной ткани путѐм растирания ткани в фарфоровой ступке, постепенным добавлением физиологического раствора.

7. Суспензию центрифугируют для осаждения крупных частиц при 1500 об/мин, надосадочную жидкость собирают и используют для последующего вирусологического исследования.

Интрацеребральное заражение. Метод предназначен для выделения нейротропных вирусов. При заражении мыши в мозг еѐ плотно прижимают левой рукой к столу, большим и указательным пальцами оттягивают кожу головы к затылку, мизинцем и безымянным фиксируют хвост. Лобный участок головы предварительно обрабатывают 3%-ной йодной настойкой. Заражающий материал (кровь) в объѐме 0,02-0,03 мл вводят в мозг

27

туберкулиновым шприцем с тонкой иглой путѐм прокола лобной кости на глубину 1,5-2 мм.

Этапы вскрытия животных:

1. Труп увлажняют раствором лизола или фенола.

2. Обрабатывают кожные покровы головы последовательно спиртом, йодом и вновь спиртом, проносят над пламенем спиртовки.

3. Вскрывают и отделяют кожу головы. Отрезают голову, помещают еѐ в стерильную чашку Петри, проведя предварительно через пламя спиртовки.

4. Вскрывают ножницами черепную коробку, извлекают мозг и сохраняют его в замороженном состоянии при -20°С до получения результата бактериологическогоÏолесÃÓконтроля.

5. В случае отрицательного бактериологического контроля из мозговой ткани приготавливают 10% суспензию в физиологическом растворе. Освобождают еѐ от крупных тканевых частиц центрифугированием, надосадочную жидкость используют для вирусологической работы.

2.2.4 Методы забора инфекционного материала от людей и животных

Необходимо учитывать тропизм виру ов к определѐнным тканям и органам, пути выделения вируса во вн шнюю реду и особенности патогенеза той или иной вирусной инф кции. Различают пневмотропные, энтеротропные, гепатотропные, имфотропные, нейротропные и дермотропные вирусы. В зависимости от тропизма, исследованию подвергают различные материа ы. Например, исследуют слизь из зева, мокроту и т.п., и вирус пневмотропный; испражнения – при энтеротропных вирусах.

Инфекционные материалы, взятые с учетом тропизма вирусов и с соблюдением асептики, п мещают в стерильную посуду, тщательно закупоривают еѐ и направляют в лабораторию, поместив в термос со льдом.

Материал рекомендуется исследовать в кратчайший срок, так как вирусы, как правило, быстро инактивируются. Сохранению вируса способствует помещение исследуемого материала (в 50% растворе глицерина) в холодильник при температуре не выше 5°С. Но самый надѐжный способ - это хранение в замороженном состоянии (-20°С и ниже); в таких условиях вирус может оставаться жизнеспособным длительное время.

Техника бработки плотного материала, содержащего вирусы:

1.Растирание его в ступке или измельчения в специальных аппаратах гомогенизаторах.

2.Готовится 10% взвесь в солевом растворе.

3.Взвесь центрифугируют (2000-3000 об/мин, 15-30 мин.) Для осаждения крупных частиц.

28

4. Вирусы остаются в надосадочной жидкости, которую и подвергают дальнейшему исследованию.

Обработка жидкого материала, содержащего вирусы: материал непосредственно центрифугируют и получают надосадочную жидкость.

Уничтожение посторонней микрофлоры.

К надосадочной жидкости добавляют антибиотики для уничтожения посторонних микроорганизмов. (пенициллин и стрептомицин (200-1000 ЕД/мл) и нистатин (20 ЕД/мл)), либо антибиотики широкого спектра действия и их сочетания (например, тетрациклин, оксациллин, гентамицин и др.) на 30-60 мин. Необходим посев материала на питательную среду для контроля на бактериологическую стерильность. Освобождѐнную от посторонней микрофлоры вируссодержащую жидкость используют для дальнейших исследований.

Концентрация вирусов. Если исследуемый материал содержит малое количество вирусов, его предварительно концентрируют двукратным центрифугированием:

- 2000-3000 об/мин., 20 минут, осаждая крупные частицы; - 40000 об/мин., 1 час ультрацентрафугируют надо адочную жидкость.

Получают желеобразный осадок, где концентрированы вирусы.

Технка взятия и обработка н которых ча то и				ледуемых материалов от
больных вирусными инфекциями:
Смыв из носоглотки:
1.	Больной пропо аскива т рот (утром до приѐма пищи и лекарств)
	стерильным физио огическим раствором или раствором Хенкса, 10 мл.
2.	Смыв п мещают во ф ак н и доставляют в лабораторию в термосе со
льдом.
3.	Смыв центрифугируют (2000 об/мин, 15 мин.).
4.	К надосад чн й жидк сти д бавляют антибиотики.
5.	Через 30-60 минут материал готов для дальнейшего исследования.
Испражнения:
1.	2-5 г помешают во флаконы, закрывают резиновыми пробками и
доставляют в лабораторию в термосе со льдом.
2.	Разводят 1:10 раствором Хенкса.
3.	Гомогенизируют в баночке		бусами путѐм встряхивания.
4.	Центрифугируют (2000-3000 об/мин, 30 мин.).
5.		ÏолесÃÓ
	К надосадочной жидкости добавляют антибиотики в значительной
концентрации.
6.	После 30-60 минутного контакта проводят высев в бульон для
бактериологического контроля на стерильность.
7.	До получения ответа		надосадочную	жидкость сохраняют в

замороженном состоянии, а затем используют еѐ для выделения вируса.

29

Методы очистки вирусов:

Для электронномикроскопических исследований, изучения физикохимических свойств вирусов необходимо иметь их высокоочищенные препараты, не содержащие посторонних примесей. Очищают вируссодержашие материалы, сконцентрированные двукратным центрифугированием при различных скоростях. Дополнительную очистку осуществляют различными физико-химическими методами.

Дифференциальное центрифугирование. Метод разделения частиц разных размеров по различной скорости их осаждения. Многократно чередуется скорости центрифугирования вируссодержащего материала:

 малая (2000-3000 об/мин);

			очистки
			вещества
	Очищаемую вируссодержащую взв сь наслаивают сверху.
	Центрифугируют, частицы раз ичных плотностей распределяются в
разных слоях раствора в виде отде ьных зон.
	В пр сы д я самоконтроля:
1.	Солевые раств ры и питательные среды, используемые для
культивирования культур клет к. Их состав. Примеры.
3.	Первичные культуры клеток. Принципы приготовления этих культур.
4.	Перевиваемые культуры клеток. Их характеристика.
5.	Диплоидные культуры клеток. Их характеристика.
6.	Применение культур клеток в вирусологии, их преимущества и
недостатки.
7.	Строение развивающегося куриного эмбриона (КЭ) и подготовка
	ÏолесÃÓ
инкубированных КЭ к заражению. Способы заражения КЭ.
8.	Преимущества и недостатки культивирования вирусов в КЭ.
9.	Культивирование вирусов в организме восприимчивого животного.
Способы заражения.
10. Применение экспериментальных животных		в вирусологии,
преимущества и недостатки.

30