Вирусология

20).

2.3 Показатели наличия вируса в культуре клеток

2.3.1Цитологические методы

2.3.1.1 Показатели по цитопатическому действию Цитопатическое действие (ЦПД) – совокупность морфологических и

функциональных (в том числе биохимических) изменений в клетках, возникающих под влиянием внедрившегося вируса. Реакция клеток на заражение вирусом может проявляться в виде острой вирусной инфекции, латентной инфекции, трансформации клеток. Более выражена реакция клеток при острой вирусной инфекции. Основной причиной ЦПД является нарушение метаболизма клетки. При резкой дегенерации клеточный монослой гибнет: клетки отслаиваются от стекла и свободно плавают в культуральной жидкости в виде бесструктурных зерен, лизируются (рисунок

1.	2.
	Рисунок 20 – 1. Культура клеток.
	2. Цитопатическое действие аденовируса в культуре клеток Hela.
	а — незараженная культура; б — зараженная культура
СимпластообразованиеÏолесÃÓ. (более 20 вирусов) – образование гигантских

многоядерных клеток - симпластов (или синцитиев) под воздействием ферментов (лецитиназы, нейраминидазы) (таблица 3).

Включения образуются, если вирус не вызывает гибели клеток, или на стадиях до наступления гибели, что может быть единственным проявлением реакции клетки на внедрение вируса.

Латентная вирусная инфекция – происходит репродукция вируса при

31

отсутствии выраженного цитопатического действия.

Трансформация клеток наступает при заражении клеточной культуры онкогенными вирусами, под действием которых клетки начинают безудержно делиться и располагаются не монослоем, а растут беспорядочно в несколько слоев. При заражении такой культурой животного, у него может возникнуть злокачественная опухоль.

Таблица 3 – Примеры цитопатических эффектов, обнаруживаемых при инфицировании вирусами животных

Цитопатические эффекты

Вирус

	ÏолесÃÓ
Морфологические изменения
Сжатие ядра (пикноз), изменения		Пикорнавирусы
мембраны
Изменение в ядерной мембране		Альфавирусы, герпесвирусы
Вакуоли в цитоплазме		Паповавирусы
Синцитий (слияние клеток)		Парамик овиру ы, коронавирусы
Разрушение хромосом		Герпе виру ы
Обособление клеток из культуры		Герпе виру ы, рабдовирусы,
ткани		ад новиру ы, пикорнавирусы
Внутриклеточные включ ния
Вирионы в ядре		Ад новирусы
Вирионы в цитоплазме:
тельца Бабеша-Негри,		Вирус бешенства
тельца Гварнери		Поксвирусы

Техника индикации вируса по его цитопатическому действию.

1. Отбирают пробирки со сплошным клеточным слоем, просматривая их под малым увеличением микроскопа.

2. Из пробирок отсасывают культуральную жидкость.

3. Вносят по 0,1 мл исследуемого материала в 4 пробирки. 4. Добавляют питательную среду до 1 мл.

5. Для контроля несколько пробирок оставляют незараженными. 6. .Пробирки выдерживают в термостате (37°С).

7. В течение недели и более ежедневно микроскопируют с целью обнаружения ЦПД.

Цитопатическое действие вируса на монослой клеток учитывают по четырехкрестовой системе:

«++++» – полный лизис клеточной культуры; «+++» – клеточный слой отсутствует, но имеются единичные клетки, не

32

пораженные вирусом; «++» – дегенеративные изменения наблюдаются у 50% клеточной

культуры; «+» – дегенеративным изменениям подверглись отдельные клетки

монослоя, главным образом в краевых участках.

Дегенеративные изменения клеточного слоя не менее чем на два креста («++») при отсутствии таковых в незараженной культуре, указывают на наличие в исследуемом материале вируса.

Титрование вирусов по цитопатическому действию. Количественное определение вирусов в исследуемом материале проводится с помощью титрования. Готовят 10-кратные последовательные разведения вируса, которыми заражают клеточные культуры (берут по 4 пробирки на каждое разведение). В остальном методика титрования вируса по ЦПД не отличается от вышеприведенной методики обнаружения вируса по ЦПД.

ОбычноÏолесÃÓпробы культуральной жидкости проверяют одновременно с несколькими типовыми сыворотками.

Титр вируса – это наибольшее разведение, вызывающее ЦПД в половине зараженных культур (т.е. в 2 пробирках из 4 с данным разведением вируса). Титр вируса вычисляется по методу Рида и Менча, и выражается в цитопатических дозах (ЦПД50) в 1 мл. За одну ЦПД50 принимают 0,1 мл вируссодержащего материала, разведенного до титра.

2.3.1.2 Показатели по н йтрализации цитопатического действия Техника идентификации выд л нного виру а по нейтрализации ЦПД.

Вируссодержащим материа ом, под жащим идентификации, обычно служит культуральная жидкость из пробирок с клеточной культурой, давших

ЦПД при заражении исс едуемым материалом.

1.	Культуральную жидк сть (с определенной дозой ЦПД50 вируса)
смешивают		равным бъем м диагностической иммунной сыворотки
(разведение сыв р тки 1:5 или 1:10).
2.	Оставляют на 1-2-часа при комнатной температуре.
3.	Из 4 пр бир к с культур й клеток удаляют питательную среду.
4.	Дозой по 0,2 мл смеси заражают эти культуры.
5.	Вносят по 0,8 мл свежей среды.

Опыт сопровождается несколькими контролями: I) контроль незараженной культуры;

2) контроль дозы вируса – клеточные культуры заражают той же дозой вируса, что и в опыте;

3) контроль культуры, зараженной смесью культуральной жидкости с нормальной сывороткой.

Опыт учитывают через 5-7 дней и более, просматривая пробирки под малым увеличением микроскопа.

В первом контроле ЦПД должно отсутствовать, во втором и третьем -

33

обязательное проявление ЦПД. Отсутствие цитопатического эффекта в опытных пробирках указывает, что в данной пробе произошла нейтрализация вируса иммунной сывороткой, т.е. сыворотка соответствует типу выделенного вируса.

Техника титрования вируснейтрализующих антител в сыворотке больного:

1. Готовят двукратные последовательные разведения исследуемой сыворотки.

2. Смешивают каждое из них со стандартной дозой известного вируса

(100, 1000 ЦПД50).

Титр сыворотки – то наибольшее разведение, которое полностью подавляет ЦПД вируса в половине взятых в опыт культур (т.е. в 2 пробирках из 4, на которых проверяют; каждое разведение сыворотки).

3. Оставляют на 1-2 часа при комнатной температуре. 4. ЗаражаютÏолесÃÓклеточные культуры.

2.3.1.2.1 Реакция нейтрализации в цветной пробе. Реакцию

используют для выявления вируса (полиомиелита) и его титрования, его

идентификации по нейтрализующему дей твию пецифической сыворотки,

для обнаружения и титрования п цифич ких вируснейтрализующих

антител в исследуемых сыворотках. Кл тки культуры ткани размножаются в среде с индикатором рН (фенолрот). При нормальном развитии клеток среда

закисляется продуктами метабо изма, цв т изменяется (из красного, рН

7,4–7,6 – в желтый, рН 7,0–6,8), при р продукции вируса в клетках нарушается их норма ьный метабо изм и цвет среды не изменяется.

Чаще всего исп ьзуют к етки почек обезьяны или перевиваемые культуры клет к. И требуется предшествующее определение метаболической активности клет к, п ск льку на может отличаться у разных культур клеток. Кроме т го, устанавливают дозу клеток – то оптимальное их количество, к т р д лжно быть взято в каждую пробирку:

Определение дозы клеток (культуры почечных клеток обезьяны): 1. Готовят взвесь клеток густотой 100-120 тыс. В 1 мл.

2. Делают ряд возрастающих двукратных разведении в объеме 0,25 мл.

3. Определяют минимальное количество клеток, которое при постановке цветной пробы изменяет цвет питательной среды из красного в желтый на 5- 6-и день выдерживания в термостате. Обычно эта доза – 25 тыс. Клеток в объеме 0,25 мл.

На воспроизводимость результатов цветной пробы, кроме типа применяемых клеток и их концентрации, влияют также состав, буферность, pH питательной среды.

Техника титрования вируса методом цветной пробы:

Цветную пробу ставят в пробирках либо в луночках плексигласовых пластин. Пробирки иногда закрывают резиновыми пробками, но чаще

34

разобщение от атмосферного воздуха достигается наслаиванием стерильного вазелинового масла (0,6-0.8 мл) или применением алюминиевой фольги. Однотипную опытную смесь наливают не в одну, а в четыре пробирки, что повышает достоверность реакции. При оценке результатов реакции учитывают только два тона: желтый и красный (табл. 7).

1. Готовят десятикратные разведения вируссодержащего материала в объеме 0,25 мл.

2. Смешивают с 1 дозой клеток, содержащейся в таком же объеме. 3. Добавляют питательную среду по 0,25 мл.

4. Наслаивают вазелиновое масло по 0,6-0,8 мл.

5. Ставят контроли клеточной взвеси: берут 1, 1/2 и 1/4 дозы клеток. Эти контроли подтверждают правильность выбора дозы клеток.

Иногда сывороткаÏолесÃÓможет оказывать на культуру клеток токсичное действие: клетки гибнут, не накапливая кислых продуктов, и цвет среды остается

6. Пробирки помещают в термостат (37°с, 5-6 дней) 7. По изменению цвета учитывают реакцию.

Титр вируса по цветной пробе называется то наибольшее разведение вируса, которое вызывает подавление метаболической активности клеток в 50% случаев. В данном примере (табл. 7) титр вируса равен 10-4 (две пробирки красные, две - желтые).

Цитопатическая доза (ЦПД50) виру а – количе тво вируса, содержащееся в объеме 0,25 мл в разведении, равном титру.

Техника титрования антит л м тодом цв тной пробы:

1.	В качестве антигена б рут изв стный, заранее оттитрованный вирус в
рабочей дозе, равной 100 ЦПД50.
2.	Как показано в примере (таб ица 4), берут дозу 100 ЦПД50 вируса
содержится в 0,25 мл разведения 10-2.
3.	Готовят двукратно в зрастающие разведения исследуемой сыворотки –
0,25 мл (кажд разведение – в 4 пробирках).
4.	Добавляют по 100 ЦПД50 вируса в равном объеме.
5.	Смеси выдерживают при к мнатной температуре 1-2 часа (чтобы могла
произойти реакция нейтрализации).
6.	Добавляют взвесь клеток в количестве одной дозы, также в объеме 0,25
мл.
7.	Ставят контроль дозы клеток и контроль сыворотки на токсичность.

красным.

8. Учет результатов реакции – через 7-9 дней инкубирования (37°С) при наличии правильных результатов в контролях.

Титр реакции (титр сыворотки) – максимальное разведение сыворотки, которое еще подавляет в 50% случаев действие 100 цитопатических доз вируса. В таблице 5 титр равен 1:64.

35

Таблица 4 – Схема титрования вируса методом цветной пробы

ТаблицаÏолесÃÓ5 – Схема титрования антит м тодом цветной пробы

36

2.3.1.3 Реакция интерференции применяется при отсутствии возможности использования перечисленных методов. Культура клеток с исследуемым материалом дополнительно заражается лабораторным штаммом вируса, вызывающим цитопатическое действие. Морфологические изменения клеток наблюдаются только в случае отсутствия вирусов в исследуемом образце в связи со способностью вирусов подавлять ЦПД другого вируса. Например, вирусы лейкоза птиц, которые интерферируют с вирусом саркомы Рауса. Но при этом надо исключить явление аутоинтерференции.

1.Что понимаютÏолесÃÓпод цитопатическим действием (ЦПД) вируса на культуру клеток, каковы видимые проявления этого действия?

2.Индикация вируса по его ЦПД и определение титра вируса. Идентификация вируса по нейтрализации ЦПД. Как

37

2.4 Серологические методы исследования в вирусологии

Все серологические реакции основаны на иммунологическом взаимодействии антигена и антитела и отличаются по способности выявлять отдельные классы антител. Реакция агглютинации, например, хорошо выявляет lgM-антитела, но менее чувствительна для определения lgGантител. В реакции нейтрализации вирусов участвуют лишь антитела, направленные против поверхностных антигенных детерминант, связанных с патогенностью.

Серологические реакции бывают прямые – основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (агглютинация, преципитация), и непрямые ÏолесÃÓ(опосредованные) реакции (непрямая гемагглютинация, связывание комплемента), а также реакции с использованием меченых антител или антигенов (иммуноферментный, радиоиммунный анализ, метод флуоресцирующих антител, иммунный блоттинг, иммуночипы).

Достоверные результаты серологической диагностики получают при изучении «парных» сывороток крови больных, взятых в первые дни болезни и через равные промежутки времени от начала заболевания. В этом случае удается наблюдать динамику нарастания титра антител.

2.4.1 Реакция нейтрализации (РН)

РН– один из основных рологич ских м тодов исследования, основан на способности специфич ских противовирусных (диагностических) сывороток нейтрализовать инф кционное д йствие гомологичного вируса. Об этом судят по резу ьтатам РТГА, цветной пробы, отсутствию цитопатическ го действия, выживаемости чувствительных животных, отсутствию изменений при заражении куриных эмбрионов. Классическая РН проводится: на культурах клет к, на куриных эмбрионах, на животных (рисунок 21).

Рисунок 21 – Реакция нейтрализации для вирусов и противовирусных антител:

«+» – положительная, «-» – отрицательная

38

Техника проведения классической РН:

1.Берут два ряда пробирок: 1) опытный, 2) контрольный.

2.В первый ряд добавляют определенное количество неразведенной диагностической иммунной сыворотки.

3.Во второй ряд – такое же количество неразведенной нормальной сыворотки такого же вида животного.

4.Отдельно в пробирках готовят несколько разведений вируса, чтобы при

добавлении их в пробирки опытного и контрольного ряда получились последовательные 10-кратные разведения вируса (например, 10-1,10-2,10-3 и т.д.). Сыворотки и добавляемые разведения вируса должны бьггь в

одинаковых объемах, например по 0,2 мл.

РН на куриныхÏолесÃÓэмбрионах (1 вариант). Подготовительная работа для этой реакции описана выше.

5. Пробирки с приготовленной смесью ставят в термостат (37°С обычно на

1-2 часа)

6. . Опытные и контрольные смеси вводят мышам или в куриные эмбрионы. Каждым разведением для достоверности опыта заражают не

менее 4 мышей или куриных эмбрионов.

РН на белых мышах (1 вариант). За зараженными животными (опытными и контрольными) устанавливают наблюдение в течение 2-х недель, регистрируют заболевших и погибших мышей. Учет реакции проводят путем сопоставления количества погибших опытных и контрольных мышей от соответствующего разведения вируса. Опр д ляют 50% смертельную дозу – LD50, проводя подсчет по Риду и М нчу. Высчитывают индекс нейтрализации (ИН) – максима ьное колич ство смертельных доз вируса, которое нейтрализуется данной сывороткой, по сравнению с результатами контрольного опыта, принимаемыми за единицу.

	ИН =	Титр вируса в пыте с нормальной сывороткой	;
		Титр вируса в пыте с иммунной сывороткой
		ИН менее 10 – отрицательный;
	Результат: ИН – 11-49 – сомнительный;
		ИН равный 50 и выше – положительный.

1. Введение смеси вируса иммунной сывороткой в куриные эмбрионы проводятся с учетом тропизма вируса. Так, вирус гриппа вводят в

амниотическую или аллантоисную полость куриного эмбриона; вирус герпеса, осповакцины наносят на хорионаллантоисную оболочку и т.д.

2.Инкубируют в термостате (35-37°С, 48 – 72 ч.).

3.Яйца вскрывают, аллантоисную или амниотическую жидкость отсасывают.

39

4. В ней определяют наличие вируса при помощи реакции гемагглютинации.

Если гемагглютинация наступила в контроле (смесь нормальной сыворотки с разведениями вируса) и отсутствует в опыте (смесь иммунной сыворотки с разведениями вируса), то сыворотка обладает нейтрализующим действием.

Титр вируса в контроле и в опыте определяют путем статистической обработки.

II вариант (на мышах и куриных эмбрионах). Реакцию ставят с

различными разведениями исследуемой сыворотки и постоянной дозой

известного живого вируса.

гемагглютинирующееÏолдействиеесÃÓвиру ов у 50% зараженных куриных эмбрионов.

1. К двукратным возрастающим разведениям сыворотки добавляют равные объемы определенного разведения вируса (рекомендуется брать 100

или 1000 LD50 вируса).

2. Выдерживают опытные и контрольные смеси 1-2 часа в термостате. 3. Вводят их мышам или куриным эмбрионам.

При постановке реакции нейтрализации на мышах за титр изучаемой сыворотки принимают разведение, дающее защитный эффект у 50% мышей.

В реакции на куриных эмбрионах титром		ыворотки	считается то
наибольшее ее разведени , которое	ще	по обно	задерживать

2.4.1.1 PH под агаровым покрыти м (метод бляшек) ставят для идентификации вирусов, вызывающих обширную деструкцию клеточного пласта. Бляшки п лучают, выращивая культуру клеток в термостате в плоских флак нах-матрацах, закрытых резиновыми пробками, иногда в чашках Петри, герметизир ванных лейкопластырем.

Покровная среда. Агар в е покрытие готовят из высококачественного агара в концентрации 1-1,5% и других компонентов – солевых буферных растворов, дополнительных питательных веществ, антибиотиков. Раствор нейтрального красного входит в состав среды или его добавляют во флакон или чашку незадолго до учета опыта. Существуют различные рецепты покровных сред, применяемые учетом типа клеточной культуры и вируса. В последнее время хорошо зарекомендовали себя покровные среды, в которых вместо агара используют гель бентионита (5-6%). Это алюмосиликат природного происхождения, который биологически инертен и не токсичен для культур клеток. Под бенгионитовым питательным покрытием бляшки хорошо выявляются.

Техника постановки метода бляшек

1. Из монослойной культуры клеток удаляют питательную среду

40