Вирусология

7. Сушат мазки при комнатной температуре и исследуют под люминесцентным микроскопом с использованием масляной иммерсионной системы.

Для оценки интенсивности специфической флюоресценции вирусов используется четырехплюсовая шкала:

«++++» и «+++» - очень яркая и яркая, «++» и «+» - выраженная и слабая зеленая флюоресценция

инфицированных клеток при мечении антител ФИТЦ. Обязательными являются три контроля:

1) обработка флюоресцирующими антителами суспензии гомологичных вирусов (положительный контроль);

флуоресцирующихÏолесÃÓиммуноглобулинов и окрашивают в течение 30—40 мин при комнатной температуре или в помещают в термостат (37°С, 15-20 мин.).

2) гетерологичной культуры (отрицательный);

3) незараженного материала (отрицательный).

2.4.7.2 Иммуноферментный анализ (ИФА) в принципе сходен с РИФ,

но основывается на мечении антител ферментами, а не красителями. Наиболее широко используется пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза, применяют также β-галактозидазу и β-лактамазы. Меченые антитела связываются с антигеном, и такой комплекс обнаруживается при добавлении субстрата для фермента, с которым конъюгированы антитела. Конечный продукт реакции может быть в виде н ра творимого осадка, и тогда учет

проводится с	помощью	обычного	в тового микроскопа, или в виде
растворимого	продукта,	который	обычно окрашен (или может

флюоресцировать или юмин сцировать) и р гистрируется инструментально.

Так же, как РИФ, иммуноферментный анализ проводится в прямом и непрямом вариантах, но, в т ичие от нее, используется твердофазная

модификация п стан вки ИФА в				унках полистироловых планшет (твердая
фаза),	в	кот рых	рбируются	антитела,	который нашел	наибольшее
распространение.
Техника постановки ИФА
1.	Фиксированные препараты помещают во влажную камеру.
2.	На	каждый	мазок наносят 50		мкл рабочего	разведения

3. Препарат ополаскивают дистиллированной водой.

4. Наносят по 50 мкл 0,01 % голубого Эванса в ФСБ (фосфатно-солевом буфере) и выдерживают еще 15 мин во влажной камере при комнатной температуре.

5. Препарат ополаскивают дистиллированной водой и промывают рабочим раствором ФСБ при покачивании на аппарате для встряхивания жидкостей (2 раза по 10—15 мин со сменой рабочего раствора ФСБ).

6. Стекла ополаскивают дистиллированной водой и высушивают под

51

вентилятором.

7. На высушенные препараты наносят по капле монтировочноиммерсионной жидкости, и просматривают их под покровным стеклом, с помощью люминесцентного микроскопа.

Учет результатов. Антигены вируса гриппа имеют вид четкой диффузной или гранулярной флуоресценции зеленого цвета в ядрах или цитоплазме клеток на кирпично-красном фоне окружающих клеток, не пораженных вирусом. В зависимости от стадии и степени репродукции вируса меняется локализация и характер флуоресценции. Вначале наблюдается нежная диффузная флуоресценция в ядре, затем в

перинуклеарной зоне. Постепенно мелкогранулярное свечение

положительныхÏолесÃÓслучаях прояв яются пожелтением, учитываются с помощью спектрофотометра.

распространяется но всей цитоплазме (свечение может быть зернистым, гранулярным и сплошным), а внутриядерное свечение ослабевает.

При этом чаще используется непрямой вариант ИФА: 1. В лунки вносят содержащий вирус материал.

2. Ставят в термостат (37°С, 30 мин).

3. К образовавшемуся иммунокомплексу добавляют антивидовой

пероксидазный иммуноконьюгат.
4.	Ставят в термостат (37°С, 30 мин).
5.	В	лунки	вносят	ортоф нил ндиамин		Н2О2 как хромогенный
субстрат для пероксидазы.
6.	на	10	мин.	Для	выявл ния	образования	тройного
иммунопероксидазного комп кса
Результаты			твердофазной		модификации	ИФА,	которые	в

2.4.7.3 Иммунная электр нная микроскопия (ИЭМ). Электронная микроскопия не п зв ляет типир вать вирусы, поскольку многие из них не имеют морфол гических различий внутри семейства. Один из вариантов ЭМ, используемом в диагностических целях, является ИЭМ (иммунная электронная микроскопия). Антитела взаимодействуют вирусом и образуют комплексы, которые после негативного контрастирования легче обнаруживаются. Этот метод более чувствителен, чем ЭМ, применяется в случаях, когда вирус не удается культивировать in vitro, например при поиске возбудителей вирусных гепатитов.

Соединясь с антителами, мечеными ферритином, вирусы в иммунном комплексе, не утрачивая присущей им структуры и конфигурации, становятся электронноплотными и легко дифференцируются в электронном микроскопе.

2.4.7.4 Радиоиммунный анализ (РИА). Метод основан на метке антител радиоизотопами, что обеспечивало высокую чувствительность в

52

определении вирусного антигена. Широкое распространение метод получил в 80-е годы, особенно для определения маркеров HBV и других некультивируемых вирусов. К недостаткам метода относится необходимость работать с радиоактивными веществами и использования дорогостоящего оборудования (гамма-счетчиков).

2.4.8 Реакция связывания комплемента (РСК) позволяет обнаружить специфические комплементсвязывающие антитела в исследуемых сыворотках и определить тип вируса. Это двухэтапная реакция, в которой используются пять ингредиентов, составляющих две системы:

диагностическая сыворотка, вирусная взвесь и комплемент (первая система),
	ÏолесÃÓ
эритроциты барана, сенсибилизированные (обработанные) специфической
гемолитической сывороткой (вторая, или индикаторная, гемсистема).
Техника постановки РСК:
1.	Сыворотка разводится, начиная с 1:5.
2.	Взвесь вирусов и комплемент (свежая или сухая сыворотка морской
свинки) титруются, так как для опыта берут я в рабочей дозе.
3.	Готовится гемсистема путем	мешивания равных объемов

гемолитической сыворотки в тройном титре и 3% взвеси бараньих

эритроцитов по осадку				посл дующим выд рживанием в термостате (37°С,
30 мин.).
4.	В каждую их трех пробирок вносят по 0,5 мл соответствующих
ингредиентов.
5.	В первую из них (опытную) на ивают сыворотку, вирус, комплемент.
6.	Во	вт рую	–	сыв р тку,	комплемент, а вместо	антигена	-
изотонический раств р натрия х рида (контроль сыворотки).
7.	В третью - антиген, к мплемент, а вместо сыворотки – тот же раствор
натрия хлорида (к нтр ль антигена).
8.	Пробирки ставят в терм стат (37°С, 1 ч.).
9.	В	каждую	пробирку вносят		по 1 мл гемсистемы,	смешивают	с

компонентами первой системы.

10. Пробирки ставят в термостат (37°С, 1 ч.). 11. Производят учет РСК.

В опытной пробирке возможны два результата реакции:

1) если в диагностической сыворотке содержатся специфические к вирусам антитела, то образованный ими иммунный комплекс свяжет комплемент и эритроциты гемсистемы останутся интактными;

2) при несоответствии сывороточных антител вирусу комплемент, оставшись свободным, присоединится к гемсистеме и вызовет лизис бараньих эритроцитов. Идентичный гемолиз должен проявиться также в двух контрольных пробирках (рис. 32).

53

ÏолесÃÓРисунок 30 – Р акция вязывания комплемента:

I – положит льная, II, III – отрицательные;

Аг – вирусный антиг н; К – комп м нт, Эр – эритроциты барана

Интенсивность РСК отмеча тся п юсами:

«++++» – п лная задержка гемо иза, жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно (резко по ожительная);

«+++», «++» – слабый гем лиз, уменьшенное количество эритроцитов в осадке (положительная);

«+» – выраженный гем лиз, жидкость окрашена в розовый цвет, незначительное количество эритроцитов в осадке (слабоположительная );

«–» – полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет цвет артериальной, или «лаковой», крови, (отрицательная).

***Чувствительность РСК повышается, если связывание комплемента проводить на холоде при температуре 4 °С в течение 18-20 ч.

2.4.9 Реакция преципитации в агарозном геле (РПГ) выполняется в лунках пластинок агарового геля в чашках Петри. Причем гель должен быть очень прозрачным и готовиться на основе агара Дифко.

1.В геле пробойником делаются четыре лунки, симметрично расположенные друг против друга.

2.Одна пара из них заполняется диагностической нормальной сывороткой.

3.Другая пара – заведомо известной и исследуемой взвесью вирусов.

54

4. Чашки Петри помещают в термостат на 24-48 ч.

При обнаружении белесоватых полос или дуг преципитации на границе между ними, реакция считается положительной. Это иммунные комплексы образованные антителами диагностической сыворотки и вирусами, которые диффундировали в толщу агара (рисунок 30).

	ÏолесÃÓ
		Рисунок 30 – Реакция преципитаци в агарозном геле:
	1 – антивирусная иммунная сыворотка; 2 – нормальная сыворотка;
		3 – вирусспецифичный антиген; 4 – исследуемый антиген
			Вопросы для амоконтроля:
1.	Перечислите основные			с рологич	кие методы исследования,
применяемые в вирусологии
2.	В чѐм сущность реакция н йтрализации (РН), ее разновидности и
примеры применения. Учет р зу ьтатов.
3.	Назовите основные этапы постановки р акция нейтрализации (РН).
Каким образом проводится учет резу ьтатов реакции?
4.	На чем	сн вана реакция гемагглютинации (РГА)? Когда она
применяется? Наз вите			сн вные этапы ее проведения. Учет результатов.
5.	Основные	этапы	реакции	непрямой	(пассивной) гемагглютинации
(РНГА или РПГА). Учет результатов.
6.	В чем суть реакции т рм жения гемагглютинации (РТГА)? В каких
случаях ее проводят? Учет результатов.
7.	Назовите этапы проведения реакции гемадсорбции (РГадс). В чем суть

проведения реакция торможения гемадсорбции (РТГадс)? Каким образом учитывается результат?

8. Какие вы знаете реакции мечеными антителами? Чем они отличаются друг от друга?

9.Назовите основные этапы проведения реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и ее разновидности. Каким образом проводится учет результатов реакции?

10.Иммуноферментный анализ (ИФА) и его разновидности и этапы. Каким образом проводится учет результатов реакции?

11.Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). В чем ее отличие от ЭМ?

55

12. В чем заключается суть радиоиммунного анализа (РИА)?

13. Назовите основные этапы проведения реакции связывания комплемента (РСК)? Когда она применяется и как проводится учет результата?

14. Реакция преципитации в агарозном геле (РПГ). В чем заключается ее суть? Назовите основные этапы ее проведения.

2.5 Молекулярно-генетические методы идентификации

2.5.1 Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (метод молекулярных зондов)

Высокоспецифичный метод, его чувствительность около 10-14 г/мл. Применяют в первую очередь для определения в клиническом материале персистирующих вирусов, при латентной вирусной инфекции, для выявления вирусов, которые не удается культивировать в культуре клеток. Основан на способности двухспиральной ДНК к денатурации и ренатурации.

Денатурация -это расхождение цепей при нагревании ДНК до 80° - 100°С или обработке ее щелочью.

Ренатурация - воссоедин ние ц п й помощью водородных связей при снижении температуры до 40°- 60°С (так называемый отжиг) и

приобретение ДНК первоначальной двухспиральной структуры.

Зонды – фрагменты ДНК и и РНК, н обходимые для молекулярной

гибридизации.

Постановка реакции мо еку ярной гибридизации:

1.

Зонды метят ради активн й (Р32), флюоресцентной или биотиновой

меткой,

2.

Соединяют

исследуемым материалом, содержащим определяемую

нуклеиновую

кисл ту,

п двергшуюся

денатурации.

Если

зонд

комплементарен

цепи

пределяемой

нуклеиновой

кислоты,

происходит

гибридизация в комплементарном участке.

3.

После отжига зонд оказывается включенным в ренатурированную

нуклеиновую кислоту и может быть обнаружен по имеющейся метке.

4.

Установление природы определяемого вируса.

2.5.2

Полимеразная

цепная

реакция

(ПЦР).

Еще

более

-18

ÏолесÃÓ

метод.

чувствительный

(до 10

г),

специфичный

и довольно дешевый

Основана на способности ДНК к денатурации и ренатурации, комплементарности цепей ДНК и использовании термостабильной ДНКполимеразы, при участии которой происходит амплификация – умножение определяемых генов (вирусных, бактериальных) или их фрагментов с определенной нуклеотидной последовательностью ДНК. В результате

56

исследуемый генетический материал накапливается в значительном количестве и может быть легко выявлен и идентифицирован (рисунок 31).

Основные этапы постановки ПЦР:

ПЦР проводят в 0,5-1,5 мл микроцентрифужных пробирках в амплификаторах с автоматической регуляцией смены температуры. Каждый из 3-х этапов цикла амплификации проводится при различном температурном режиме.

1. Денатурация – разъединение определяемой двухспиральной ДНК на две изолированные цепи (90-950С , 0,5-1,0 мин.).

2. Отжиг – восстановление двухцепочечной структуры ДНК в области присоединенияÏолесÃÓкомплементарного праймера (40-600С, 0,5 мин.).

3. Удлинение (элонгация) – достройка каждой цепи ДНК о

двухцепочечного состояния с помощью термостабильной ДНК-полимеразы –

(70-750С, 2-5 мин.)

Наличие ДНК после повторных циклов амплификации определяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, авторадиографией или другими методами. Выявление РНК-виру ов проводят применением обратной транскриптазы.

Рисунок 31 – Схема полимеразной цепной реакции

Вопросы для самоконтроля:

1. Молекулярно-генетические методы исследования, их сущность, применяемые реакции.

2.Принцип метода молекулярной гибридизации.

3.Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Ингредиенты реакции, их характеристика, значение амплификации.

4.Сущность ПЦР. Назовите основные этапы постановки ПЦР.

5.Практическое применение и оценка молекулярно-генетических методов диагностики вирусных инфекций.

57

3 БАКТЕРИОФАГИ

Бактериофаги – группы вирусов, паразитирующие на бактериях. Фаги различаются по форме — нитевидные, сферические; имеющие головку и хвостик; по размерам — мелкие, среднего размера и крупные (рисунок 32).

Чем крупнее фаги, тем больше у них генов и сложнее их жизненный цикл.

1 — нитевидная форма (фаг fd); 2 — гексагональная головка с отростком и сократительным чехлом (фаги Т2. Т4. Тб); 3 — гексагональная головка с длинным, не

способным к сокращению хвостиком; 4 — головка коротким отростком (фаги ТЗ. Т7); 5 — октаэдр; 6 — ико аэдр

К самым маленьким относятся фаги М13 и фХ174.

Фаг М13 — нитевидный, г ном — однонит вая кольцевидная молекула

ДНК содержит 8 генов. Оболочка в виде нити, состоит из 3000 белковых субъединиц, уложенных по спира и. Д ина вириона 1000 нм, его диаметр 6 нм.

Фаг фХ174 — икосаэдр, диаметр 25 нм. Геном — однонитевая кольцевидная м леку а ДНК, с стоящая из 5400 нуклеотидов, несет 9 генов. Капсид постр ен из 60 м екул бе ка F, вирион имеет 12 вершин, на каждой из них вмонтирован шип, с держащий 5 молекул белка G и одну молекулу Н-

белка (белок-л цман).

Наиболее сл жно устр ены крупные фаги, состоящие из головки и

хвостика.

Фаг Т2 состоит из (рисунок 33): головки – икосаэдр (двунитевая линейная

ДНК, около 200 генов) и помощью воротника и зонтика связана с

РисунокÏолесÃÓ32 – Различные формы фаговых вирионов (по Г. Шлегелю, 1972):

хвостиком. Хвостик — полый внутри стержень, заканчивающийся шестиугольной пластинкой шестью шипами. Имеет белковый чехол из 144 субъединиц (24 спирали). Хвостик имеет 6 ворсинок, обеспечивающие плотное прикрепление фага к бактериальной клетке. Длина хвостика сильно варьирует. Белковый чехол, сокращаясь, обеспечивает проникновение стержня через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану.

58

ÏолесÃÓРисунок 33 – Схематическое изображение фага Т2:

1 – головка; 2 – воротничок; 3 – чехол; 4 – полый стержень; 5 – базальная пластинка нитями; 6 – оболочка бактерии; 7 – ДНК

Свойства фагов

Резистентность. Устойчивость фагов к факторам окружающей среды достаточно велика. Они выдерживают нагревание до 75°С, не обезвреживаются в малых концентрациях дезинфицирующих веществ, резистентны к антибиотикам, хлороформу и ф рментным ядам, что широко используется при выделении фагов из бакт риальных популяций, весьма чувствительным ко всем тр м микробоцидным веществам. Быстро разрушаются фаги в же удочном соке, а также под воздействием ультрафиолетовых лучей, ионизирующих излуч ний. В организме человека сохраняются в течение 7-10-13 дней, что при проведении профилактических мероприятий в чагах кишечных инфекций требует повторного назначения фагов контактным (инфицир ванным) ицам.

Антигенн сть и специфичн сть фагов. Белки фагов - хорошие антигены и при парентеральн м введении вызывают выработку антител. По антигенной структуре фаги п дразделяются на серогруппы и серовары.

Типоспецифичность – способность лизировать только определенные серовары данного вида. Монофаги (видоспецифические фаги) разрушают все штаммы вида, но на разных особях популяции размножаются неодинаково интенсивно. Полифаги, способные лизировать родственные бактерии, встречаются редко.

Фаги способны вызывать лизис бактериальных клеток при выращивании в жидких или твердых питательных средах. Проявляется действия бактериофагов: в суспензии бактерий – просветление бактериальной культуры или ее полная прозрачность, на поверхности агаризованной питательной среды – отсутствие роста бактерий.

Лизис культуры может быть в виде стерильных пятен, фаговых бляшек или негативных колоний фага.

59

По величине негативные колонии подразделяются на крупные, средние, мелкие и точечные. Диаметр образующихся колоний пропорционален скорости репродукции фага, скорости освобождения фаговых частиц из клеток и их адсорбции на поверхности неинфицированных бактериальных клеток и может быть пропорционален размеру фаговых частиц, что определяет скорость их диффузии в агаре. Следовательно, крупные фаги образуют мелкие негативные колонии, фаги с небольшим размером вирусной частицы – крупные негативные колонии.

Морфология негативной колонии – специфичный признак. Фаговые бляшки могут быть прозрачными или мутными.

развития, так называемого латентного периода.

Взаимодействие каждой частицы фага с бактериальной клеткой характеризуетÏолесÃÓся определенной протяженностью внутриклеточного периода

Латентный период - это минимальный промежуток времени с момента адсорбции фага до лизиса клетки. Первая половина латентного периода, во время которой еще не удается обнаружить в зараженной клетке

инфекционный фаг, называется скрытым периодом.

Выход (урожай) фага – среднее количе тво частиц бактериофага,

освобождаемых клеткой в момент лизи а.

Средний выход фага – отнош ние общего количества

бляшкообразующих единиц (БОЕ) фага к чи лу первоначально зараженных бактерий.

2.1 Методы, испо ьзу мые в работе с бактериофагами

Фаги можно бнаружить помощью электронного микроскопа и по эффекту их действия на чувствите ьные микробы.

Размножаясь в буль нных культурах, они вызывают просветление среды, на агар вых газ нах, п давляют рост бактерий, формируют колонии в виде мелких стерильных (негативных) пятен - бляшек фага (рис. 15). Вирулентные фаги обычно образуют прозрачные бляшки, а умеренные - мутные.

Рисунок 34 – Бляшки фагов в газоне культуры бактерий на агаровом геле

60