Работа 108. Определение скорости пероксидного окисления липидов в биомембранах

Реактивы. Трис-HCl буфер, 0,04 М раствор с рН 7,4^*; соль Мора – Fe(NH₄)₂(SO₄)₂, 4·10^-5 М свежеприготовленный раствор; трихлоруксусная кислота, 40%-ный раствор; тиобарбитуровая кислота, 0,8%-ный свежеприготовленный раствор; оксалат натрия, 1,34%-ный раствор; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор; хлорид калия, 1,2%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; пастеровские пипетки; резиновая груша; водяная баня с термометром или водяная баня аппарата Варбурга; аптечные весы с разновесами; спектрофотометр или ФЭК типа КФК-2.

Материал.

1. Кровь, взятая в смеси с раствором оксалата натря в соотношении 10:1 (по объему).

2. Печень свежезабитого животного.

а. Определение скорости пероксидного окисления липидов в мембранах эритроцитов. Метод основан на определении содержания конечного продукта пероксидного окисления липидов – малонового диальдегида, который при взаимодействии с тиобарбитуровой кислотой образует окрашенный в розовый цвет триметиновый комплекс, имеющий максимум поглощения при 530-532 нм:

Окраска раствора пропорциональна концентрации малонового диальдегида. Молярный коэффициент экстинкции 1,56·10^-5л·моль^-1·см^-1.

Ход определения. Оксалатную кровь центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, осаждая эритроциты. Верхний слой отсасывают, а осадок эритроцитов трижды промывают раствором хлорида натрия и переосаждают при том же режиме центрифугирования.

Отбирают 0,5 мл осадка эритроцитов в чистую центрифужную пробирку, приливают равный объем дистиллированной воды и оставляют стоять 30 мин для полного гемолиза.

Пробу центрифугируют 30 мин при 3000 об/мин, осторожно отсасывают пастеровской пипеткой надосадочную жидкость с серой прослойкой мембран эритроцитов и переносят в другую пробирку.

Берут три чистые пробирки. В первую опытную вносят по 0,3 мл растворов соли Мора, трис-буфера, аскорбиновой кислоты и 0,1 мл полученной взвеси мембран эритроцитов. Во вторую опытную приливают 0,3 мл трис-буфера, 0,1 мл взвеси мембран эритроцитов и 0,6 мл дистиллированной воды. В третью (контроль) добавляют те же реактивы, что и в первую пробирку, после чего сразу приливают 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

Все пробирки помещают в водяную баню (или в баню аппарата Варбурга) и инкубируют пробы 20 мин при 37˚С. Реакцию в опытных пробах останавливают, добавляя в обе пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

Все пробы центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Сливают надосадочную жидкость (ее объем 2 мл) в три другие пробирки, прибавляют по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем пробирки охлаждают в ледяной воде.

Измеряют экстинкцию полученных проб против контроля на спектрофотометре при 532 нм или на ФЭКе (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет по формулам

Е₁3∙6 Е₂3∙6

х₁ = ———— и х₂ = ———— ,

0,156 0,156

где х₁ – скорость образования в пробе малонового диальдегида в присутствии прооксидантов (индуцированное пероксидное окисление липидов), нмоль∙ч^-1;

х₂ – скорость образования в пробе малонового диальдегида в отсутствие прооксидантов (спонтанное пероксидное окисление липидов), нмоль∙ч^-1;

3 – объем пробы, мл;

6 – коэффициент пересчета на 1 час;

0,156 – экстинкция 1 нмоля при 532 нм;

Е₁ и Е₂– экстинкции соответственно первой и второй проб против контроля.

б. Определение скорости пероксидного окисления липидов в гомогенатах тканей. Принцип метода описан выше.

Ход определения. Навеску 0,5 г печени гомогенизируют в 19,5 мл охлажденного до 0-4˚С раствора хлорида калия, поместив стакан гомогенизатора в лед или снег. Полученный гомогенат сливают в пробирку.

В одну пробирку наливают 2,0 мл гомогената и 0,2 мл дистиллированной воды, во вторую – 2 мл гомогената и по 0,1 мл растворов аскорбиновой кислоты и соли Мора, в третью – те же вещества, что и во вторую, и, кроме того, добавляют 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты.

Все пробирки помещают на 10 мин в водяную баню при 37˚С, после чего прибавляют в первые две пробирки по 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Далее все пробы центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.

По 2 мл надосадочной жидкости отбирают в три чистые пробирки, приливают по 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы в кипящую водяную баню на 10 мин. После этого их охлаждают в ледяной воде до комнатной температуры.

Измеряют экстинкцию всех проб против контрольного раствора (2 мл раствора хлорида калия, 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1 мл раствора тиобарбитуровой кислоты, выдерживают 10 мин на кипящей водяной бане и охлаждают в ледяной воде до комнатной температуры) на спектрофотометре при 532 нм или ФЭКе (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Расчет проводят по формулам:

Е₁(Е₂)3∙3,2∙6 Е₃3∙3,2

х₁ (х₂)= —————— и х₃ = —————— ,

0,156∙2 0,156∙2

где х₁ – скорость спонтанного пероксидного окисления липидов в гомогенатах, измеряющаяся в наномолях образовавшегося малонового диальдегида в пробе за час инкубации;

х₂ – скорость аскорбат-зависимого неферментативного пероксидного окисления липидов в наномолях образовавшегося малонового диальдегида в пробе за час инкубации;

х₃ – содержание малонового диальдегида в исходном гомогенате, нмоль;

Е₁, Е₂ и Е₃– экстинкции соответственно первой, второй и третьей проб;

3,2 – общий объем исследуемых проб, мл;

2 – объем надосадочной ждкости, взятой на определение малонового диальдегида, мл;

3 – объем проб, взятых на фотометрию, мл;

0,156 – экстинкция 1 нмоль малонового диальдегида в 1 мл при 532 нм;

Оформление работы. Рассчитать полученные результаты, дать сравнительную характеристику скорости спонтанного и индуцированного пероксидного окисления липидов, сделать вывод о возможности использования метода для оценки скорости пероксидного окисления липидов и его применимости на практике.

Практическое значение работы. Методы определения скорости пероксидного окисления липидов биомембран важны для оценки действия на эту систему природных веществ и ксенобиотиков, среди которых могут быть как прооксиданты, так и антиоксиданты. Эти исследования дают возможность практически использовать выявленный эффект различных соединений, в том числе лекарственных средств.

Увеличение скорости пероксидного окисления липидов возможно при старении, гиповитаминозе Е, дефиците селена, действии ионизирующего облучения, гипербарической оксигенации (действии кислорода под повышенным давлением), при некоторых заболеваниях и патологических состояниях (сердечно-сосудистых заболеваниях, гипоксии, отравлении четыреххлористым углеродом, гипервитаминозах А и D и т.д.).

Гемоглобин и кислород, содержащиеся в эритроцитах, ускоряют пероксидное окисление липидов, что вызывает повреждение мембран эритроцитов и их гемолиз. Защита эритроцитарных мембран осуществляется системой антиоксидантов: токоферолами, имеющимися в мембранах и плазме крови, глутатионпероксидазой, обезвреживающей гидропероксиды липидов, и альбумином плазмы, который связывает пероксиды липидов.

При недостаточности антиоксидантной системы развиваются гемолитические состояния, которые часто провоцируются некоторыми пищевыми факторами и лекарственными средствами.