А) б) в) г)

Рисунок 31 – МР-изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности «мульти-эхо»: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл

В последовательности RARE – модифицированной «мульти-эхо» последовательности (рисунок 32) каждый сигнал эхо регистрируется при воздействии определенного фазово-кодирующего градиента. Каждый сигнал эхо используется для заполнения соответствующей строки матрицы k-пространства одного или двух изображений. Обычно используется от 8 до 16 сигналов эхо [53].

Рисунок 32 – Диаграмма модифицированной «мульти-эхо» последовательности

На рисунке 33 представлены МР Т2-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE, с параметрамиTE=12 мс,TR=4200 мс, 16 эхо.

А) б) в) г)

Рисунок 33 – МР Т2-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл

На рисунке 34 представлены МР Т1-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RAREс параметрамиTE=7.5 мс,TR=1500 мс, 16 эхо.

А) б) в) г)

Рисунок 34 – МР Т1-взвешенные изображения печени мыши, полученные с использованием импульсной последовательности RARE: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 0,1 мг/мл, в) - 1,0 мг/мл, г) - 10,0 мг/мл

Градиентные последовательности

Интенсивность сигнала в последовательности градиентное эхо (GRE) определяется соотношением:

,

где α – угол отклонения вектора намагниченности, TE – время эхо, TR – время повторения.

Контраст МР-изображений при использовании такой импульсной последовательности сильно зависит от времени . Диаграмма импульсной последовательности градиентное эхо представлена на рисунке 35.

Рисунок 35 – Диаграмма импульсной последовательности градиентное эхо

Среди быстрых градиентных последовательностей чаще применяют последовательности GRE. Градиентные последовательности позволяют использовать короткие TR. Интенсивность сигнала после серии 90ºимпульсов уменьшается и полностью исчезает, когда система достигает состояния равновесия (насыщения). В таких условиях более эффективны импульсы с углом отклонения менее 90º.

Градиентные последовательности, имеющие короткие TR, называют FLASH.

Интенсивность сигнала для быстрых импульсных FLASH последовательностей, если TR меньше T1, но больше T2*, или при использовании специальных очищающих градиентных полей для устранения поперечных когерентностей, можно определить из следующего соотношения:

,

где - угол отклонения; TR – время повторения; TE – время эхо; T1 – время спин-решеточной релаксации, T2 – время спин-спиновой релаксации.

К основным параметрам (TR, TE и TI) последовательность FLASH добавляет угол отклонения α. Градиентные последовательности, как и спин-эхо последовательности позволяют получать взвешенные изображения в зависимости от времени повторения эхо, угла отклонения, вида последовательности.

В последовательности FLASH интенсивность сигнала достигает максимального значения при угле отклонения 30-60º.

В последовательности «очищенная FLASH» полностью устраняется влияние поперечных когерентностей с помощью градиентных полей, восстанавливая естественный контраст последовательности «частичное насыщение».

В градиентной последовательности с усиленным контрастом (CE-FLASH) T2-взвешенность зависит от значений TR и TE. При больших TE T2-взвешивание лучше, но отношение сигнал/шум ухудшается.

На рисунке 36 представлены МР-изображения мыши, полученные с использованием импульсной последовательности градиентное эхо с параметрами TE= 5 мс, TR = 500 мс.

а) b)

Рисунок 36 – МР-изображения мыши, полученные с использованием импульсной последовательности градиентное эхо: а) – контроль, б) – контраст на основе наночастиц оксида железа 1,0 мг/мл

Таким образом, в ходе исследований была разработана общая методология получения суперпарамагнитных наночастиц, пригодных для неинвазивной инструментальной диагностики методом молекулярной МРТ. В соответствии с основными принципами разработанной методологии были синтезированы лабораторные образцы суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, обеспечивающих повышение контраста МРТ изображений при сканировании животной модели мышей. На наличие контрастирующих свойств препаратов указывали значения удельной намагниченности, коэффициентов релаксационной эффективности и прямые наблюдения гипоинтенсивных МР-изображений органов при внутривенном введении магнитных наночастиц в организм мыши (рисунки 31, 33, 34, 36).

5.1. Теоретическое моделирование эффекта внерезонансного насыщения в молекулярно-клеточных структурах, содержащих нанодисперсные частицы оксида железа, для усиления контрастности магнитно-резонансных изображений

Внерезонансное насыщение (ВРН) – новый перспективный метод МРТ, который значительно увеличивает контрастность изображений, особенно при детектировании специфичных биомаркеров раковых заболеваний – суперпарамагнитных наночастиц оксида железа invivo.

Недавние разработки новых МР-контрастных агентов и новых методов МРТ с улучшенными чувствительностью и контрастностью изображения быстро нашли распространение в применениях молекулярно-клеточной МРТ [49–52]. По сравнению с парамагнитными металло-хелатами с низким молекулярным весом, такими как Gd-DTPA, суперпарамагнитные наночастицы (Fe₃O₄[53–55],MnFe₂O₄[56], нанокристаллыFeCo[57]) продемонстрировали существенно более высокие молярные релаксивности и улучшенную чувствительность дляinvivoМРТ. Поверхностная функциональность суперпарамагнитного оксида железа (SPIO) обеспечила многочисленные примеры контрастных агентов-мишеней, которые специфично распознают маркеры раковых заболеваний, такие как рецепторы трансферрина [58], фолата [59], иHer-2/neu[60, 61]. После присоединения к мишени-маркеру или после вхождения в клетку наночастицыSPIOмогут создавать существенные возмущения в локальных магнитных полях, приводя к быстрой расфазировке спинов протонов и потере интенсивности сигнала магнитного резонанса.T₂илиT₂^*-взвешенные методы МРТ – наиболее общие, применяемые для контрастирования изображений в случае использования наночастицSPIO.T₂^*-взвешенные изображения, получаемые с помощью импульсных последовательностей градиентного эхо (GRE) часто имеют низкие отношения сигнал/шум.T₂^*-взвешенная МРТ высокочувствительна к магнитной восприимчивости, продуцируемой присутствием агентов на основеSPIO, вызывая значительное уменьшение сигнала МР, зависящее от эффективных размеров аккумулированныхSPIOагентов. Конечно, исчезновение изображения от влиянияSPIOагентов может быть труднее дифференцировать относительно других исчезновений сигнала, вызываемых, например, некоторой магнитной анизотропией вследствие наличия границы раздела тканей. В отличие от этих ограничений, в некоторых недавних исследованиях приводятся сообщения о новых МРТ-методиках, позволяющих потенциально улучшить контрастность МР изображений с помощью агентов на основеSPIO[62–69]. Так Сеппенвульде и др. сообщили о методике, называемой «Белый маркер», разработанной для того, чтобы проследить за парамагнитными маркерами, установленными в катетере, вставляемом в свиную абдоминальную аорту [62]. Положительный контраст был достигнут расфазировкой спиновых прецессий протонов основного сигнала, в то время как на сигнал рядом с маркерами дипольное поле, генерируемое ими, не действовало.

Каннинхам и др. сообщили об использовании похожего метода, чтобы получить позитивный контраст от клеток, меченых суперпарамагнитными наночастицами [63]. В другой работе меченые SPIO стволовые клетки в крысином сердце были визуализированы с помощью методики «a sweep imaging with Fourier transformation (SWIFT) technique», в которой ядра возбуждались свипируемым радиочастотным полем вместе с одновременной обработкой сигнала [64].

Недавно, Зуркия и др. [67] и научная группа Джинминг Гао [68, 69] сообщили о применении метода внерезонансного насыщения для продуцирования позитивного контраста от SPIOнаночастиц. Эта методика включала применение насыщающего РЧ-импульса на внерезонансной частоте, и позитивный контраст был получен взятием отношения или вычитания изображений с насыщением и без насыщения. Результаты предварительных исследований [69] продемонстрировали эффективность метода ВРН для детектированияinvivoраковых мишеней – суперпарамагнитных полимерных мицелл (СППМ) в мышах, больных раком. Разработка и применение ультрачувствительных СППМ вместе с методом ВРН обеспечили значительное усиление чувствительности детектирования МРТ вплоть до пикомолярного диапазона концентраций наночастиц. Метод ВРН также позволил улучшить контрастность изображения по сравнению с обычным методомT₂-взвешенного изображения. Способность обеспечить увеличенные чувствительность и контрастность МР изображений при продуцировании позитивного контраста сделали ВРН многообещающим методом для молекулярной МРТ.

Теоретическая модель эффекта ВРН

Когда наночастица SPIOнамагничивается внешним магнитным полем, времена релаксации соседних протонов воды сильно укорачиваются. При этом предполагается, что все молекулы воды внешней сферы имеют быструю диффузию в шкале ЯМР-времени, и что сигнал от основной массы воды может характеризоваться одиночным набором времен поперечной (T₂) и продольной (T₁) релаксации. После приложения слабого гладкого длительного РЧ волнового импульса с уровнем мощностиὠ₁(ὠ₁= 2πB₁,B₁в Гц) и расстройкой частоты Ω в течение времениt, динамику намагниченности ослабленного сигнала воды можно описать уравнением Блоха:

, (29)

где ,,,

M_z⁰– Z-компонента равновесной намагниченности в статическом внешнем магнитном поле. Решение уравнения Блоха (29) может быть выражено как

, (30)

где M⁰ – вектор намагниченности в начальном состоянии до насыщения, иM^∞- намагниченность в устойчивом состоянии,

(31)

. (32)

Отметим, что второй член в уравнении (30) представляет собой разность намагниченностей в первоначальном и устойчивом состояниях, модулированную зависящей от времени функцией e^{- At} (e^{- At}конвергируется в 0 приt→ ∞).

Уравнение (32) – основное для нахождения Z-намагниченности в устойчивом состоянии (M_z^∞ далее обозначается какM_z) и понимания ее взаимосвязи с параметрами МРТ. ЗависимостьZ-намагниченности от мощности РЧ насыщения (ὠ₁), расстройки частоты насыщения (Ω) и времен релаксацииT₁иT₂может быть предсказана и оценена с помощью этого уравнения. На отношениеZ-намагниченностей (M_z/M_z⁰) [70] водного раствора при данных временах релаксацииT₁иT₂сильно влияет расстройка частоты насыщения (Ω). При частоте насыщения, расположенной далеко от пика связанной воды, |Ω|→∞, отношениеM_z/M_z⁰приблизительно равно 1, поскольку член Ω²T₂²становится доминирующим фактором в уравнении. Другими словами, интенсивность ВРН пренебрежимо мала из-за того, что намагниченности в начальном и устойчивом состояниях эквивалентны. Наоборот, уменьшение отношенияM_z/M_z⁰или более ярко выраженный контраст ВРН ожидается, когда установка частоты насыщения приближается к резонансной частоте воды, или |Ω|→0 м.д. Член Ω²T₂²становится менее доминирующим и времена релаксации играют большую роль во влиянии на интенсивность ВРН, приводя к меньшему отношениюM_z/M_z⁰.

В работе [69] было рассмотрено ВРН растворов СППМ и его зависимость от частоты насыщения и концентрации СППМ. Для томографии ВРН in vivo использовались заранее определенные параметры визуализации, такие как мощность насыщения ὠ₁и расстройка частоты Ω.

С этими известными параметрами можно предсказать и оценить интенсивность ВРН (M_z/M_z⁰). Чтобы проверить это, уравнение (32) можно преобразовать так, чтобы получить упрощенную модель для оценки интенсивности ВРН растворов СППМ.

Уравнение (32) может быть преобразовано к виду

(33)

где , которое далее приводится к.

В условиях ВРН с относительно большим значением Ω (например, Ω ≥ 900 Гц или 3 м.д.), где 1/ Ω²<<T₂², уравнение (33) станет равным:

(34)

Уравнение (34) показывает линейное соотношение между интенсивностью ВРН и временем продольной релаксации (T₁) и обратно пропорционально времени поперечной релаксации (T₂) растворов СППМ при данной мощности насыщения и частоте.

Для образцов тканей уравнение (34) может быть далее преобразовано таким образом, чтобы показать корреляцию между интенсивностью ВРН и концентрацией СППМ [69]:

(35)

где , иT₂endo– время эндогеннойT₂релаксации.

Так как T₂endoдлиннее чем 200 мс и пробы СППМ имеют высокие r₂значения, то 1/T₂endo<<r₂ [СППМ]. Уравнение (35) тогда станет:

(36)

Линейное соотношение между интенсивностью ВРН и концентрацией СППМ предсказывается уравнением (36). Эти уравнения показывают, что интенсивность ВРН сильно зависит от T₂-релаксивности и концентрации СППМ проб в дополнение к ее зависимости от мощности насыщения и расстройки частоты. Важно отметить, однако, что похожее замещение (1/T₁endo+r₁[СППМ]) для 1/T₁не будет упрощать рассматриваемое уравнение из-за того, что оба члена будут наиболее вероятно одного и того же порядка величины. Это из-за того, что СППМ не являются эффективными T₁релаксационными агентами с низкими значениямиr_1.

Данная теоретическая аппроксимированная модель контрастирования МР изображений методом ВРН была экспериментально подтверждена в исследованиях с суперпарамагнитными полимерными мицеллами (СППМ) с прецизионно контролируемыми структурными свойствами [69]. Отобранные по размеру, монодисперсные наночастицы Fe₃O₄(6.1 ± 0.2 нм) были использованы для образования ряда СППМ нанопроб со специфично контролируемой толщиной короны (венца) с помощью 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-methoxypoly(ethyleneglycol) (DSPE-PEG) с различнымиPEGмолекулярными весами (Рис. 27).

Для количественной оценки эффекта ВРН используют коэффициент ВРН или отношение ВРН, определяемое как

K _ВРН = 1-(M_sat/M₀),

где М_sat– интенсивность изображения при ВРН,М₀–интенсивность изображения без насыщения. Это отношение аналогично по смыслу коэффициенту переноса ядерной намагниченности (MTR). Усиление эффекта ВРН характеризуется более высокими значениями отношения ВРН.

Рисунок 27 – (А) Иллюстрация механизма СППМ индуцированного ВРН контраста и (В) схематическое представление СППМ различной длиной PEG короны, но одного и того же Fe₃O₄ ядра. В ВРН контрасте импульс внерезонасного РЧ насыщения воздействует только на СППМ-содержащие протоны воды. Вследствие быстрой диффузии воды и большой длительности РЧ импульса устойчивое состояние достигается с меньшей интенсивностью сигнала.

Сравнение методов ВРН и МТ

Метод внерезонансного насыщения, применяемый для SPIO наночастиц, по своей технической реализации в случае слабых магнитных полей идентичен методу внерезонансного насыщения, применяемого для наблюдения эффекта переноса ядерной намагниченности (magnetization transfer - MT) [71]. В случае использования SPIO наночастиц in vivo эти два эффекта часто накладываются друг на друга. Поэтому, чтобы дифференцировать эти два эффекта необходимо знать особенности метода внерезонансного насыщения в случае эффекта переноса ядерной намагниченности. В методе переноса ядерной намагниченности в системе биополимер – вода [72] производится насыщение протонов макромолекул не на частоте резонанса протонов воды, но, конечно, в пределах резонансной линии протонов биополимера, поэтому термин «внерезонансное» следует понимать условно. Происходит процесс переноса ядерной намагниченности от мало подвижных протонов в биополимере на протоны свободной воды, и эффективность этого переноса можно наблюдать по уменьшению сигнала ЯМР от протонов воды по сравнению с сигналом, принятым от них в отсутствии насыщения протонов макромолекул. Однако намагниченность не может быть передана от протонов в биополимере непосредственно протонам подвижной воды, так как время их взаимодействия слишком мало. Поэтому такой перенос возможен лишь при наличии молекул воды, присоединенных к биополимеру и живущих достаточно долго в этом положении. Существование такого взаимодействия (гидратации) не подвергается сомнению [73], хотя его природа достаточно сложна и понятна не до конца. Механизмы передачи ядерной спиновой намагниченности в молекулярно-клеточных структурах рассмотрены нами подробно в п. 1.1.

Схематически основные этапы переноса намагниченности представлены на рис. 28.

Рисунок 28 – Схематическое представление процесса переноса намагниченности в системе «макромолекула – свободная вода».

Насыщающие РЧИ действуют («выжигают») только в узком частотном диапазоне (рис. 29), но из-за того, что линию биополимера в слабом магнитном поле можно считать однородно уширенной [90], эффект насыщения распространяется по всей ширине линии («спиновая диффузия»), на рис. 29 – широкая линия малой интенсивности. Так как спиновые подсистемы контактируют между собой, то протоны биополимера выводят из равновесия протонную систему воды, уменьшая продольную компоненту ее намагничености (узкая линия малой интенсивности).

Рисунок 29 – Наглядное представление изменений спектральных линий в процессе переноса насыщения:

–исходный спектр биополимера;

– исходный спектр воды;

– локально насыщенная («выжженная») линия биополимера;

(широкая) – линия биополимера, ослабленная спиновой диффузией;

(узкая) – линия воды, передавшая намагниченность подсистеме спинов биополимеров.

Таким образом, эффект ВРН в присутствии SPIO отличается от эффекта переноса ядерной намагниченности (МТ) тем , что он основывается на том, что диффузия молекул воды проходит вдоль определенных разделительных областей, которые определяются границами изоповерхностей магнитного поля, а не обязательно каким-то физическим разделением. В эффекте переноса ядерной намагниченности происходит химический или какой-то другой физический обмен протонами [71]. Для того, чтобы определить, что ВРН в присутствии SPIO происходит не вследствие переноса ядерной намагниченности, этот эффект был изучен в растворах с различным pH. Госсуин и др. [74, 75] предварительно использовали этот подход, чтобы различить эффекты внешней и внутренней сфер. Группы OH, локализованные на поверхности частиц, показывают амфотерный характер (см. рис. 30).

Рисунок 30 – Группы OH, локализованные на поверхности частиц, имеют различное число обмениваемых протонов в зависимости от pH.

При низких значениях pH, поверхность более протонирована, увеличивая число потенциально обменноспособных протонов, что приводит к более выраженной релаксации.

Протонный обмен от этих групп может управляться изменением pH. Так как изменения вpHвоздействуют на скорость обмена, то изменения вpHбудут действовать на процесс переноса ядерной намагниченности, в то время как эффект ВРН в присутствии SPIO, в основном зависящий от диффузии, должен оставаться постоянным при изменениях вpH, для которых наночастицы остаются стабильными. Рисунок 31 показывает, что независимость отношения ВРН отpHдля наночастицFeridexпредполагает, что происходит процесс вследствие диффузии, а не от обмена, как в случае переноса намагниченности [67].

Рисунок 31 – Зависимость коэффициента ВРН (отношения ВРН) от pH для разных значений расстройки частоты.

В применениях in vivo, где используются наночастицыSPIO, чаще всего эффектыMTи ВРН аддитивны. Если желательно разделить эти эффекты, то необходимо сначала оценить эффект МТ перед использованиемSPIO, тогда изображение с МТ будет служить как базовым, и его можно будет вычесть из аддитивного изображения.

Экспериментальные исследования моделей молекулярно-клеточных структур, содержащих нанодисперсные частицы железа, методом ВРН.

Эффект внерезонансного насыщения (ВРН) был проверен экспериментально на модельных образцах в присутствии магнитных наночастиц железа в работах Зуркия [67]. Было продемонстрировано, что он отличается от эффекта переноса ядерной намагниченности (MT), обусловленной процессами диффузионного обмена и может наблюдаться даже при наличии эффекта MT. Были исследованы зависимости эффекта ВРН от параметров внерезонансного насыщения, концентрации наночастиц,pH, и скорости диффузии. На основе экспериментальных данных была построена простая модель эффекта ВРН. Эффект ВРН усиливается с увеличением концентрации наночастиц железа. Он усиливается пропорционально размеру оболочки, но также сильно зависит от диффузии. Зависимость от диффузии можно выразить через времяδt, в течение которого протон находится на оболочке частицы. Тогда приближенное выражение для отношения ВРН может быть записано, как:

(37)

где k – коэффициент пропорциональности (константа),V_shell – объем части воды, захваченной оболочкой, который зависит от характеристик намагниченности частиц, их концентрации, расстройки частоты внерезонансного насыщения.T представляет длительность внерезонансного облучения, величиной порядка миллисекунд, в то время какδt – порядка десятков наносекунд или микросекунд в зависимости от размера оболочки. Поэтому выражает диффузионно-опосредованный насыщением объем, который больше, чем объем, определяемый только внерезонансной частотой. Простая оценкаδt может быть сделана используя объем оболочки и коэффициент диффузии из уравнения Δzrms= (2Dδt)^1/2, где Δz_rms – усредненная толщина данной оболочки. Уравнение (37) приводит к кривым, представленным на рис. 32, которые показывают усиление эффекта ВРН для малых констант диффузии и для малых расстроек внерезонансной частоты, что находится в полном соответствии с экспериментальными данными.

Рисунок 32 – Графики, моделирующие зависимость эффекта ВРН от скорости диффузии. Каждый график соответствует одной и той же расстройке резонансной частоты.

Выводы:

1. Метод ВРН, использующий наночастицы оксида железа, позволяет осуществить генерацию изображения, в которой существует положительная корреляция между интенсивностью изображения и концентрацией суперпарамагнитных наночастиц.

2. Эффект ВРН не ограничен объемом спинов при определенной установке частоты, а усиливается диффузией в течение периода времени импульса насыщения.

3. Зависимость эффекта ВРН от скорости диффузии делает возможным использование эффекта ВРН в присутствии SPIOкак метода оценки скорости диффузии. В клинических применениях этот подход может быть полезен для диагностики заболеваний, в которых на диффузию может влиять какая-либо патология, например, ишемические очаги, дифференциация между раковыми и абсцессными инфекционными заболеваниями.

4. Эффект ВРН зависит как от мощности облучения, так и от магнитных характеристик самих частиц, поскольку как различные магнитные свойства, так и различные характеристики покрытия частиц влияют на процесс диффузии вокруг этих частиц.

5. Поскольку эффекты ВРН, обусловленные SPIO и переносом ядерной намагниченности, особенно в случае химического обмена, взаимно дополняют друг друга, то перспективно в случае контрастных частиц на основе SPIO комбинировать оба эти эффекта для повышения контрастности изображений.