Выполнение задания.

1. Отобрать из семян супер­элиты ячменя сорта Винер 3 пробы по 500 зерен.

2. Приготовить растворы мутагена N-нитрозоме-тилмочевины 2 концентраций — 0,01 и 0,008%.

3. По­местить 2 порции семян в растворы мутагена соот­ветствующей концентрации, третью — замочить в воде.

4. Через 18 ч семена промыть в проточной воде и под­сушить.

5. Семена всех вариантов одновременно вы­сеять в поле.

6. Данные об обработке семян следует занести в таблицу.

№10-практическая работа. Мутации. Критерии множественного аллелизма.

Задание. 1. Ознакомиться с типами структурных изменений хромосом и методами их изучения. 2. Определить митотическую активность в меристеме корешков лука-батуна после обработки мутагеном и сравнить с контролем. 3. Установить наличие и про­цент аберраций хромосом у мутантов. 4. Определить типы аберраций.

Материал и оборудование. 1. Препараты срезов корешков лука-батуна (контрольных и после обработки мутагенами пророс­ших семян). 2. Микроскоп с рисовальным аппаратом.

Пояснения к заданию. Любым структурным изме­нениям хромосомы предшествует ее разрыв, при ко­тором получаются два новых «клейких» конца. Такие «клейкие» концы способны соединиться с любым дру­гим (но только «клейким») концом. Если соединяются концы, возникшие при одном разрыве, восстанавли­вается целость хромосомы — структурных изменений не происходит. В случае же соединения концов, воз­никших при разных разрывах, получается новое расположение генов в хромосоме, т. е. появляются струк­турные изменения хромосом.

Характер хромосомных аберраций зависит от со­стояния, хромосомы в момент воздействия мутаген­ного фактора. Если хромосома находится в состоянии одиночной нити, то в период S интерфазы она удваивается и аберрация сохраняется в обеих хроматидах, т. е. возникают хромосомные аберрации (рис.7). Если мутаген действует на хромосому, находящую­ся в состоянии двойной нити (периоды S и G₂ интер­фазы, профаза и метафаза митоза), аберрация может образоваться в каждой нити отдельно. В этом случае возникают так называемые хроматидные аберрации.

Рис. 7. Характер перестроек хромосом в митотическом цикле клетки.

Различают внутри и межхромосомные аберрации. К внутрихромосомным относятся делеции, инверсии и дупликации.

Делеция (нехватка)—выпадение участка хро­мосомы, содержащего один или несколько генов. В случае утери хромосомой концевого участка возни­кает концевая делеция, при утере внутреннего уча­стка — интерстициальная делеция.

Инверсия — разрыв хромосомы в двух местах одновременно с сохранением внутреннего участка, ко­торый поворачивается на 180°. Инверсия может быть парацентрической, если оба разрыва происходят в од­ном плече хромосомы, или перицентрической, если разрывы происходят по обе стороны от центромеры (в обоих плечах одновременно).

Дупликация — удвоение одного и того же уча­стка хромосомы, содержащего одни и те же гены.

Межхромосомными аберрациями называют струк­турные изменения, затрагивающие одновременно две или более негомологичные хромосомы. К таким струк­турным изменениям хромосом относятся трансло­кации.

Транслокация — обмен участками между не­гомологичными хромосомами.

Организмы, в клетках которых имеются хромосом­ные аберрации, чаще всего бывают маложизнеспособ­ны или нежизнеспособны.

Изучение хромосомных аберраций можно прово­дить двумя методами — метафазным и анафазным. Метафазныи метод заключается в анализе аберраций в метафазе митоза. Он довольно точен, но в связи с тем, что у многих растений хромосомы распознавать в метафазе трудно, его используют лишь для объек­тов, имеющих четко различимые хромосомы, напри­мер скерды. Анафазный метод пре­дусматривает анализ хромосомных аберраций в ана­фазе митоза. Чаще всего они представляют собой мосты (рис. 8.) и фрагменты. Их образование можно, например, представить так, что при разрыве обеих хроматид в результате репликации образуются две сестринские хромосомы с разрывом в одном и том же месте. В дальнейшем при соединении концов сестринских хромосом, как правило, получаются две новые хромосомы: одна без центромеры (ацентрическая), другая с двумя центромерами (дицентрическая). В анафазе митоза дицентрическая хромосома одно­временно тянется к обоим полюсам, образуя мост. Ацентрическая хромосома (фрагмент) располагается случайно и в дальнейшем элиминируется. В описан­ном случае происходит дупликация и делеция одно­временно. Если в анафазе образуются не мосты, а лишь беецентромерные фрагменты,— значит, налицо структурные изменения типа делеций. Удобный объект для изучения хромосомных аберраций — проросшие семена лука-батуна, ячменя и других растений, пред­варительно обработанные химическими мутагенами или облученные гамма-лучами в соответствующей дозе.

Изучение хромосомных аберраций следует про­водить в самом начале прорастания корешков, на первых митотических делениях клеток меристемы.

Выполнение задания. 1. Семена лука-батуна зама­чивают на 50 ч при температуре 24 °С. К этому вре­мени корешки обычно достигают длины 5 мм.

Рис.8. Анафаза митоза в меристематической клетке зародышевого кроешка ячмена после воздействия мутагена.

№11-практическая работа. Геномные мутации. Микроскопический анализ препаратов хромосом с целью изучения различных форм гетероплоидии.

Задание. 1. Ознакомиться с наиболее широко применяемыми методами получения полиплоидов. 2. Провести колхицинирование проростков ржи. 3. Высадить полученные проростки в ящики. 4. Подсчитать число хромосом на временных или постоянных пре­паратах, приготовленных из точек роста проростков.

Материал и оборудование. 1. Семена ржи. 2. Чашка Петри диаметром 8—10 см. 3. Раствор колхицина (концентрация 0,25%). 4. Ящик с почвой. 5. Микроскоп. 6. Препарат (постоянный или временный), приготовленный из точки роста проростка, выросшего из колхицинированного семени.

Пояснения к заданию. Методов получения поли­плоидных растений довольно много. Большая часть этих методов основана на колхицинировании. Колхи­цин — желтовато-белый или белый порошок; он отно­сится к группе алкалоидов; добывают его из расте­ния — безвременника осеннего. Слабые растворы этого вещества парали­зуют процесс образования тянущих нитей веретена. Поэтому в митозе хромосомы не расходятся к полю­сам, клетка не делится, и образуется ядро с тетра-плоидным (2пХ2) набором хромосом. Если на обра­зовавшиеся тетраплоидные клетки продолжать воздействие колхицином, то могут возникнуть окто-плоидные клетки, а если действовать колхицином на последующие деления, то число хромосом в клетках может увеличиться в 4, 8, 16 и более раз. Но обычно такое увеличение числа хромосом снижает жизнеспо­собность клеток и даже обусловливает их гибель.

Для получения полиплоидов чаще всего исполь­зуют 0,1—0,25%-ный водный раствор колхицина, ко­торым обрабатывают прорастающие семена или верхушки Молодых побегов, находящиеся в состоянии интенсивного деления клеток. Следует избегать попадания раствора колхицина на корни, так как это ослабляет тетраплоидные растения.

При обработке растений с длинным подсемядольным коленом (например, проростки гречихи) исполь­зуют следующий метод. В чашке Петри на фильтровальной бумаге проращивают семена, разложив их по периметру чашки. Когда проростки достигнут длины 4—6 см, чашку с проростками вставляют в другую, большего диаметра, в которую наливают 0,05%-ный раствор колхицина. Проростки пригибают таким об­разом, чтобы семядоли и конус нарастания находи­лись в растворе колхицина, налитого в чашку боль­шего диаметра. Через 12—24 ч их вынимают, пропо­ласкивают в воде и сажают в почву.

Полиплоидные растения можно получать и другим методом. На молодые проростки, почки, побеги накла­дывают ватный тампон, смоченный колхицином. Для этого пинцетом осторожно отодвигают в стороны моло­дые листочки и между ними вкладывают как можно глубже ватный тампон, чтобы он находился в непосред­ственной близости от точки роста. Лучше всего тампон вкладывать вечером и следить, чтобы он все время на­ходился во влажном состоянии. Ежедневно тампон смачивают раствором колхицина. Через 2—5 дней вату снимают, и верхушки побегов промывают водой. Рост обработанных побегов приостанавливается, они силь­но утолщаются, появляются толстые мясистые листья. Через 2—4 недели рост побега возобновляется.

При колхицинировании значительная часть расте­ний погибает; это нужно учитывать и брать для опыта семена в достаточном количестве.

Полиплоиды можно получать также с помощью аценафтена. Он действует слабее, но не вызывает у обработанных побегов такой сильной депрессии в росте, как колхицин. Аценафтен слабо растворим в воде, поэтому растения обрабатывают им преиму­щественно следующими способами.

1. Семена покрывают влажной фильтровальной бумагой, на которую сверху насыпают порошок аце­нафтена. Семена выдерживают таким образом 2— 4 дня, а затем высаживают в поле.

2. Молодые сеянцы, выращенные в горшках в теп­лице, прикрывают химическим стаканом, смазанным внутри ланолином, на который насыпано 2—4 г аценафтена. Через день стакан снимают.

Выполнение задания. 1. В чашке Петри на фильт­ровальной бумаге прорастить в течение 2—3 дней се­мена ржи районированного сорта.

2. Когда колеоптиле достигнет 2—4 мм длины, по­местить проростки в 0,25%-ный водный раствор кол­хицина. Для этой цели в чистую чашку Петри, имею­щую диаметр на 1—2 см меньше, чем фильтровальная бумага, на которой проращиваются семена, наливают раствор колхицина.

Бумагу с проростками вынимают из чашки Петри и перевертывают таким образом, чтобы верхушки про­ростков оказались в растворе колхицина, а корни при­крыть сверху бумагой, чтобы они не высыхали.

3. Через 30 мин проростки вынуть из раствора колхицина, промыть дистиллированной водой, выса­дить в ящик и поставить в теплицу.

4. Через 30 дней отобрать тетраплоидные расте­ния. Они отличаются толстыми мясистыми листьями, неправильными искривленными побегами.

5. Подсчитать число хромосом и проверить плоидность отобранных растений на временных или по­стоянных препаратах, приготовленных по обычной цитологической методике.

Определение числа хромосом в клетках диплоид­ного и тетраплоидного растений может быть темой са­мостоятельного занятия.

№12-практическая работа. Определение генетического сходства и степени гомозиготности популяции.

Задание. 1. Познакомиться с законом Харди — Вейнберга. 2. Вычислить частоты генотипов в популяции озимой ржи сорта Вятка, растения которой различаются по антоциановой окраске всходов.

Задание характеризует частоты фенотипов, различающихся по окраске всходов в популяции озимой ржи сорта Вятка 2.

Пояснения к заданию. Английский математик Г. Харди и немецкий врач В. Вейнберг в 1908 г. неза­висимо друг от друга установили закон, которому подчиняется частота распределения гомозигот и гетерозигот в свободно скрещивающейся популяции, и выразили его в виде алгебраической формулы. Со­гласно этой формуле частота членов пары аллельных генов в популяции распределяется в соответствии с формулой бинома Ньютона (р + q)²=1 или р² + 2pq+q² =1

Закон Харди—Вейнберга гласит: в неограниченно большой популяции при отсутствии факторов, изме­няющих концентрацию генов, при свободном скрещи­вании особей, отсутствии отбора и мутирования данных генов и отсутствии миграции численные соотно­шения аллелей АА, аа и Аа остаются из поколения в поколение постоянными.

Этот закон дает возможность определить вероят­ность содержания генотипов АА, Аа и аа в свободно скрещивающейся популяции.

Условия, при соблюдении которых действует этот закон, практически невозможны ни в одной реально существующей популяции, поэтому закон Харди — Вейнберга следует рассматривать как закон, приме­нимый для идеальной (модельной) популяции, хотя он и лежит в основе динамики всех типов популяций.

Пример. У озимой ржи антоциановая (фиолето­вая) окраска всходов — доминантный (А) признак по отношению к зеленой (а) окраске, N — число особей в популяции, D — число гомозиготных особей с гено­типом АА, R — число гомозиготных особей с геноти­пом аа, Н — число гетерозиготных особей с геноти­пом Аа.

Выполнение задания. 1. Определить состав попу­ляции. Он будет представлен следующей формулой: N=D+R+H

2. Вычислить число генов А и число генов а в дан­ной популяции сорта Вятка 2 по формуле A (число генов) =2D + Н, так как каждое растение D имеет два гена A, а каждое растение Н — один ген A.

Число генов а — 2R + Н, так как каждое расте­ние R имеет два гена а, а каждое растение Н — один ген.

3. Вычислить частоту (долю) генов A в популя­ции. Она обозначается буквой р и вычисляется по формуле:

p=2D+H / 2N=D+ ¹/₂H / N.

4. Вычислить частоту генов а в популяции (q) по формуле:

p=2R+H / 2N=R+ ¹/₂H / N.

5. Пользуясь формулой Харди — Вейнберга, вы­числить состояние равновесия в популяции при p= 0,6 и q= 0,4 и частоте генотипов AA=0,10, Aа = 0,20 и аа = 0,70.

Следует обратить внимание, что популяция при таком соотношении генотипов неустойчива, и уже в следующем поколении в ней устанавливается рав­новесие, которое сохраняется и в дальнейших поко­лениях.

Таким образом, в рассматриваемом примере в по­пуляции ржи сорта Вятка 2 во всех поколениях со­храняется соотношение генотипов с антоциановой окраской всходов (гомозигот) AA=0,36, гетерозигот Aа = 0,48 и с зеленой окраской всходов аа = 0,16. При этом сохраняется частота гена А — р = 0,6 и частота гена а — q = 0,4.

№13-практическая работа. Знакомства с динамикой генеотипов в чистых линиях и популяциях.

Задание. Вычислить процент гетерозиготных особей в 10-м по­колении гибридной популяции яровой пшеницы, полученной от скрещивания сортов Фильгия и Саратовская 29.

Пояснения к заданию. В природе даже у самых строгих облигатных самоопылителей, как например пшеница, ячмень, овес и др., бывают случаи пере­крестного опыления. Однако эти случаи довольно редки и немногочисленны, поэтому сорта-самоопыли­тели обычно продолжительное время сохраняют свою генетическую однородность.

У пшеницы красная окраска колоса (А) по отно­шению к белой окраске (а)—доминантный признак. Сорт Фильгия, имеющий красную окраску колоса, скрещивают с белоколосым сортом Саратовская 29, а затем проводят самоопыление полученной гетерозиготной популяции F₁ в последующих поколениях.

Выполнение задания. 1. Составить схему образо­вания гетерозигот и гомозигот в 3 поколениях гиб­ридной популяции

PP♀AA X ♂ аа

F₁ Aa

F₂ AA+2Aa+aa

F₃ 4AA+2AA+4Aa+2aa+4aa,

или 6AA+4Aa+6aa, или 3AA+2Aa+3aa

F_n (2^n-1-1)AA+2Aa+(2^n-1 –1)aa

2. В соответствии с полученной формулой опре­делить частоту гетерозиготных растений в популяции в 10-м поколении:

F₁₀ (2⁹— 1) АА+2Аа + (2⁹— 1)аа = 511 АА + 2Аа + 511аа

3. Определить процент гетерозиготных особей в гибридной популяции ФильгияXСаратовская 29 к 10-му поколению. Расчет удобно выполнять в фор­ме таблицы.

Таким образом, в 10-м поколении у самоопыляю­щихся растений число гетерозигот составит около 0,1%. Доминантных гомозигот будет около 49,45% и рецессивных гомозигот — около 49,45%.

№14-практическая работа. Оценка влияния элементарных факторов эволюции на структуру популяции.

Задание. 1. Ознакомиться с причинами, нарушающими равно­весие в популяции. 2. Определить изменение соотношения процента особей с различными генотипами в поколениях при полной элими­нации рецессивных гомозигот.

Пояснения к заданию. Равновесие в популяции может нарушаться под влиянием таких факторов, как мутационная изменчивость, увеличение или уменьше­ние численности популяции, избирательность оплодо­творения, отбор и др. Причем наибольшее значение имеет направление отбора.

Динамика генетической структуры популяции вы­ражается в изменении соотношения разных геноти­пов в поколениях. Генофонд популяции может пополняться большим или меньшим числом мутаций. Этот процесс накопления мутаций называется мутацион­ным давлением. Например, мутирование аллеля А в аллель а или обратно может нарушить равновесие в популяции, т. е. изменить соотношение генотипов АА, Аа и аа. Каждая вновь возникшая мутация подвергается действию отбора, т. е. все особи, у ко­торых возникает мутация, снижающая жизнеспособ­ность или плодовитость, полностью или частично эли­минируются. Если возникшая мутация доминантна, то все обладающие ею особи подвергаются действию отбора в первом поколении. Если же мутация рецес­сивна, то она подвергается действию отбора только в гомозиготном состоянии. В этом случае мутантные рецессивные гены могут накапливаться в популяции в гетерозиготном состоянии. Поэтому элиминация ре­цессивных генов в популяции мало эффективна: в каждом последующем поколении рецессивные го­мозиготы будут появляться вновь из гетерозигот Аа в результате их расщепления.

При выполнении данного задания в качестве при­мера может быть рассмотрена популяция озимой ржи, у которой частота доминантных генов р = 0,5, частота рецессивных генов q — 0,5, а гомозиготное со­стояние рецессивного гена обусловливает полную стерильность цветков.

Доминантный ген F как в гомозиготном, так и в гетерозиготном состоянии обусловливает нормаль­ное развитие фертильных цветков. В этом случае коэффициент отбора (коэффициент элиминации), обо­значаемый буквой S, для рецессивных гомозигот ff равняется 1, то есть эти гомозиготы в каждом поколении бесплодны, не завязывают семян.

Согласно заданию в исходной популяции частоты доминантного и рецессивного генов равны и состав­ляют р = 0,5 и q = 0,5.

При S = 1 частота генов в популяции вычисляется

по формуле: q_n=q/1+nq,

где п — число поколений, для которых ведется расчет.

Для удобства расчетов следует вычислять не ча­стоты генотипов, а процент особей с соответствующим генотипом.

Выполнение задания. 1. Вычислить процент осо­бей с генотипами FF, Ff, ff в исходной популяции при S = 1 и q = 0,5. Данные занести в таблицу, умножив предварительно на 100, чтобы перевести их в проценты. Расчет ведется по формуле:

P² +2hq+q²=1

(0,5)²+ (2 X 0,5 X 0,5)+ (0,5)² = 1.

Следовательно, в исходной популяции будет сле­дующее соотношение генотипов: 25% FF; 50% Ff и 25% ff.

Динамика изменения соотношения генотипов в популяции при полной элиминации рецессивных гомозигот (S = 1)

Поколение	Частота доминантного гена p	Частота рецессивного гена q	Процент особей с генотипом
			ff (q^2)	Ff (2pq)		FF (p^2)
Исходное 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 n	0,500 0,667 0,750 0,800 0,833 0,857 0,875 0,889 0,900 0,909 0,917 0,955 Pn=1-qn	0,500 0,333 0,250 0,200 0,167 0,143 0,125 0,111 0,100 0,091 0,083 0,045 qn=q/1+nq	25,00 11,12 6,25 4,00 2,78 2,04 1,56 1,23 1,00 0,83 0,69 0,20 q^2n		50,00 44,44 37,50 32,00 27,78 24,51 21,88 19,74 18,00 16,54 15,22 8,60 2pnqn		25,00 44,44 56,25 64,00 69,44 73,44 76,56 79,03 81,00 82,63 84,09 91,20 p^2n

2. Вычислить частоту гена f в популяции первого поколения q₁ по выше приведенной формуле (для по­пуляции первого поколения п=1):

q₁=0,5/1+(1X0,5)=0,5/1,5=0,333

2. Определить частоту гена F:

p₁=1-q₁=1-0,333=0,6677

4. Таким же образом вычислить частоты доми­нантного и рецессивного генов и определить процент особей с генотипами FF-44,4%, Ff и ff во втором, третьем и последующих поколениях. Как видно из таблицы, при полной элиминации рецессивных го­мозигот с генотипом ff в каждом поколении соотношение генотипов в популяции изменяется: к 20-му по­колению численность доминантных гомозигот FF воз­растает с 25 до 91,2%, численность рецессивных гомозигот ff уменьшается с 25 до 0,2%. Числен­ность гетерозигот Ff тоже уменьшается в поколениях с 50 до 8,6 %, но уменьшение их идет медленнее, чем рецессивных гомозигот.