Жидкостная цитология

Справочник заведующего КДЛ /№ 9 сентябрь 2008

Преаналитические технологии в современных цитологических исследованиях

В.А. Крюкова

ведущий эксперт Отдела преаналитики и клинической биохимии ООО “ОМБ”

В настоящее время произошло существенное расширение значения цитологических исследований в клинической практике, в большой степени обусловленное использованием новых технологий. Современные методы взятия и подготовки проб позволили расширить спектр биоматериалов для выполнения исследований. Наряду с традиционными цитологическими исследованиями на базе оптической микроскопии в настоящее время активно применяются автоматизированные цитологические системы, использующие новые методы детекции изображения. Эффективность цитологического исследования, заключение которого является основанием для разработки тактики лечения, находится в большой зависимости от качества приготовления цитологического препарата.

Развитие современной цитологии определило создание новых технологий на преаналитическом этапе:

~методы “жидкостной цитологии” (Liquid based cytology) (ЖЦ) для клеточных суспензий, полученных из соскобов, отпечатков, традиционных пунктатов, препаратов тонкоигольной биопсии, жидких биоматериалов, субпопуляций клеток крови, концентратов из разного типа жидкостей, получаемых при диагностике и лечении пациента;

~методы быстрой фиксации клеток на разных типах слайд*-препаратов (прямая фиксация на стекле) и клеток в суспензии жидкого цитологического препарата (предварительная фиксация “в объеме” – Liquid suspension fixation);

~методы очищения и разделения жидких клеточных проб при использовании градиентного и фильтрационного центрифугирования;

~методы обработки суспензии до нанесения клеток на слайд (дифференциальный лизис отдельных типов клеток, депротеинизация и очищение раствора от фрагментов клеток, отмывка клеток, коррекция концентрации клеток в конечном препарате, выделение отдельных популяций клеток методом цитофлуометрии, окраска цитоплазмы и ядер клеток, введение флуоресцентных или люминесцентных меток и зондов);

~методы нанесения клеточного материала на слайд с получением высококачественного тонкослойного препарата для микроскопии и смежных областей (автоматические фильтрационные закрытые технологии и цитоцентрифугирование);

~методы автоматической поэтапной окраски и обработки нанесенных на слайд клеточных препаратов;

~специальные технологии (гибридизация, отмывка и введение флуоресцентной метки при FISH-диагностике (флуоресцентной гибридизации для диаг-

*Предметное стекло (микроскопа), англ.

11

На правах рекламы

Практикум специалиста

ностики фрагментарных мутаций генома), инициация митоза для цитогенетических исследований, предварительное культивирование выделенных клеток в препарате на специальном оборудовании).

Современные технологии на преаналитическом этапе также позволяют проводить дополнительные исследования:

~цитогенетические исследования хромосом при стимуляции митозов клеток непосредственно в цитологическом препарате;

~прямое иммунохимическое определение вирусов в клетках;

~функциональное морфологическое исследование клеток иммунной системы с введением флуоресцентных и люминесцентных зондов, в т. ч. при искусственной активации иммунокомпетентных клеток;

~лекарственный мониторинг с использованием мембранных и внутриклеточных зондов;

~диагностические исследования патологических изменений отдельных типов клеток, выполняемые при помощи микроскопического анализа in situ в сочетании с предварительным выделением нужной популяции методом проточной цитофлуометрии или культивированием клеток на специальных системах и слайдах;

~молекулярно-генетические исследования на основе FISH-технологий.

Проба, подготовленная методом ЖЦ, также может быть использована в ком-

плексных клинико-диагностических исследованиях. Аликвотирование пробы для других тестов (биохимия, иммунохимия, молекулярно-генетические исследования, бактериология и др.) может быть проведено закрытым способом в пробирке при помощи современных вакуумных технологий.

Жидкостная цитология (Liquid based cytology)

Основным путем повышения достоверности цитологического метода исследования является использование метода “жидкостной цитологии” (ЖЦ). Для получения высококачественных цитологических препаратов используется жидкостная цитологическая система. Клеточную популяцию из биоматериалов разного типа вносят в специальный контейнер с транспортным раствором, который “консервирует” собранный клеточный материал, препятствует повреждению клеток, позволяет избежать бактериального загрязнения и позволяет в оптимальных условиях доставить собранные клетки в лабораторию. Помимо этого материал, полученный методом ЖЦ, устойчив к колебаниям температуры, его можно хранить в течение нескольких месяцев и использовать для проведения дополнительных или контрольных исследований.

Современные технологии ЖЦ позволяют получать тонкослойные клеточные препараты высокого качества из широкого спектра биоматериалов. После взятия биоматериала проводят его обработку, выполняя несколько операций: смывание клеток с инструмента и получение суспензии клеток в специальной среде со стабилизацией морфофункционального состояния клеток, консервацией пробы, денатурацией белка, удалением слизистых субстанций, частичным разрушением межклеточных связей, лизисом эритроцитов и фиксацией “в объеме”. Далее следуют операции для оптимизации расположения клеток на стекле (концентрирование или разведение).

12

Справочник заведующего КДЛ /№ 9 сентябрь 2008

Первичная обработка проводится как на месте взятия проб биоматериала, так и в лаборатории (в зависимости от типа и задач цитологического исследования). Во всех случаях конечным результатом обработки является получение стабилизированной суспензии клеток, являющейся жидким цитологическим препаратом.

Пробы (рис. 1), полученные при использовании ЖЦ, могут быть двух типов: с фиксированным (1) и нефиксированным (2) клеточным материалом. Для получения проб используют специальные многокомпонентные растворы, в состав которых входят: фиксирующие спиртовые смеси 30–50% (этанол, метанол, изопропанол), которые также способствуют денатурации внеклеточных белков; муколитические вещества, разрушающие слизь; 2–3% растворы кетонов и альдегидов (фиксаторы клеточных структур); водно-солевые буферные растворы; полиолы и детергенты (дезагреганты и стабилизаторы жидких суспензий).

Рис. 1. Использование метода жидкостной цитологии

Предварительно фиксированные “в объеме” ЖЦ пробы в основном используют для PAP-скрининга (онкологического скрининга на основе метода окраски по Папаниколау) в гинекологии и урологии или для исследования некоторых биожидкостей. Однако при предварительной фиксации вероятно механическое повреждение клеток. Многие виды цитологических исследований могут быть выполнены только в живых клетках, поэтому для них фиксацию мазка проводят перед окраской непосредственно на слайде. Далее при необходимости проведения комплексных исследований аликвоты суспензии клеточного материала наносят на препарат (слайд). Последующие операции проводят с клетками, расположенными на слайде.

Используются разные типы слайдов и разные технологии изготовления препарата, о которых будет сказано ниже.

При необходимости для предварительно незафиксированных проб проводится фиксация на стекле. Далее цитологические препараты проходят несколько стадий ручной или автоматической окраски. Флуоресцентные и люминесцентные

13

Практикум специалиста

метки и зонды могут быть внесены как в фиксированные, так и в нефиксированные препараты в зависимости от цели исследования. Могут быть также применены специальные методы обработки слайдов (методы цитогенетики, стимуляции изменения функционального состояния клеток, FISH-анализа, культуральные методы).

Преимущества жидкостной цитологии:

~повышение эффективности цитологических исследований;

~доступность для исследования большей части клеток популяции взятого биоматериала;

~получение достаточной плотности клеток на слайде даже при их низкой исходной концентрации;

~все виды исследований для любых жидких и концентрированных (пунктаты, мазки, клеточные колонии клеток) биоматериалов;

~высокое качество изготовления препаратов за счет дополнительной пробоподготовки (гемолиз эритроцитов, денатурация белка, разрушение слизи и т. д.);

~автоматизация на преаналитическом и аналитическом этапах;

~регулировка плотности клеток в препарате путем коррекции их концентрации в суспензии и выбора режима изготовления препарата;

~фиксация клеток непосредственно в суспензии и длительное хранение таких проб для контрольных и повторных исследований;

~расположение клеточного материала на определенном месте слайда (в т. ч. многоканальное), что улучшает возможности маркировки препарата, повышает скорость и качество аналитической стадии цитологического исследования;

~использование проб ЖЦ и других видов лабораторных исследований (комплексное исследование биоматериала) или проведение специальных видов исследований для более точной диагностики.

Технологии нанесения клеток на слайд-препарат

вжидкостной цитологии

Внастоящее время разработаны три типа технологий изготовления цитологических тонкослойных слайд-препаратов. Каждая технология имеет свои модификации, отличающиеся используемыми реактивами, уровнем автоматизации

иназначением для ручного или автоматического анализа.

1.Технология ThinPrep (Cytyc Corporation) – закрытая автоматическая система для гинекологического РАР-скрининга, исследования некоторых типов биожидкостей, препаратов, полученных при помощи тонкоигольной аспирационной биопсии (ТИАБ), и молекулярно-генетических исследований.

Этапы технологии ThinPrep: 1. Получение пробы в жидкой форме (биожидкости) или при смыве со специальной щетки или шпателя с использованием специального контейнера, который содержит фиксирующий клетки транспортный раствор. 2. Автоматическое перемешивание, вакуумная фильтрация, концентрация клеток на фильтре, аппликация клеток в определенную зону специального слайда и окраска по Папаниколау (все операции проводятся внутри специального устройства по закрытой технологии). 3. Автоматический или ручной анализ препарата.

Особенности технологии ThinPrep: а) обязательная фиксация клеток в раст­ воре PreservCyt; б) специальная патентованная фильтрационная технология изго-

14

Справочник заведующего КДЛ /№ 9 сентябрь 2008

товления слайда с последующей окраской непосредственно в специальном приборе; в) возможность использования только контейнеров, слайдов, растворов и реагентов этого производителя.

2.Технология SurePath™ (Bekton Dikinson) – полуавтоматизированная закрытая система для гинекологического РАР-скрининга и исследования некоторых других биожидкостей.

Этапы технологии SurePath: 1. Получение пробы в жидкой форме (биожидкости) или при смыве со специальной щетки или шпателя с использованием специального контейнера, который содержит фиксирующий клетки транспортный раствор. 2. Перемешивание. 3. Автоматическое дозирование жидкой пробы в пробирки со специальным раствором для градиентного центрифугирования. 4. Очищение и концентрирование исследуемых клеток центрифугированием в градиентном растворе. 5. Аликвотирование клеточного осадка, его разведение, перемешивание. 6. Дозирование клеточной суспензии в цитокамеру, которая закреплена вертикально на специальном слайде. 7. Инкубация для проведения пассивной седиментации (осаждение) в ограниченную просветом цитокамеры зону слайда. 8. Окраска по Папаниколау. 9. Автоматический или ручной анализ препарата.

Особенности технологии SurePath™: а) обязательная фиксация клеток в транспортном растворе SurePath™; б) необходимость специального прибора-дозатора на стадии подготовки к градиентному центрифугированию; в) градиентное центрифугирование для отделения исследуемых клеток от мешающих анализу примесей; г) необходимость специального прибора для дозирования, пассивной седиментации клеток на слайд и окраски препарата; д) возможность использования расходных материалов (растворы, контейнеры, слайды) только этого производителя.

3.Технологии цитоцентрифугирования – Cyto System (Andreas Hettich GmbH) и CytoSpin (Thermo Shandon Inc) – открытые технологии, основой которых является нанесение тонкослойного клеточного препарата на слайд из пробы, полученной при использовании ЖЦ во время горизонтального центрифугирования в системах специальной конструкции, где цитокамеры герметично соединены с поверхностью слайдов. Процесс осаждения клеток на слайд под действием центростремительной силы происходит аналогично процессу в центрифужной пробирке. Технология CytoSpin реализуется при использовании специальной цитоцентрифуги, которая имеет ограниченный ряд моделей цитокамер сложной конструкции. Технология Cyto System осуществляется на универсальных лабораторных центрифугах разной производительности при помощи многофункциональных или специализированных роторов. Обе системы включают в себя варианты цитокамер, предназначенных для различных объемов и концентрации проб,

имогут иметь несколько рабочих каналов для создания от 2 до 8 рабочих зон на одном препарате.

Этапы технологии цитоцентрифугирования (ЦЦ) (рис. 2): 1. Получение пробы. 2. Перемешивание пробы. 3. Проведение дополнительных операций по улучшению качества цитологического препарата непосредственно в цитокамере (отмывка

иосветление клеточных суспензий, лизис эритроцитов, разделительное центрифугирование в градиентном растворе, коррекция концентрации клеток). 4. Дозирование пробы в герметичную систему из цитокамеры и слайда. 5. Горизонтальное цен-

15

Практикум специалиста

трифугирование с осаждением клеточных элементов на слайд и получением препаратов для фиксации и окраски (возможна фиксация и окраска слайдов непосредственно в цитокамере). 6. Высушивание препарата в специальной подвеске центрифуги за счет эффективной системы вентиляции, возникающей при вращении ротора. 7. Автоматический или ручной анализ.

Рис. 2. Горизонтальное центрифугирование

1.Операции с клеточными суспензиями (отмывка, концентрирование, разведение)

2.Получение слайд-препарата при центрифугировании в горизонтальном роторе

3.Высушивание при помощи фильтр-вставки и в специальной подвеске центрифуги

Особенности технологии ЦЦ. В системах ЦЦ реализованы все преимущества ЖЦ. Применение этой технологии на преаналитическом этапе возможно в любых областях современной цитологии и комплексных диагностических схемах. Технология ЦЦ может в перспективе стать альтернативой использования закрытых систем на основе жидкостной цитологии с предварительной фиксацией суспензии клеток, так как обеспечивает более гибкий режим, адаптируемый к конкретным методам цитологического исследования на общей методической и технической базе. ЦЦ – открытая технология, обеспечивающая сохранность клеток для исследования и получение высококачественных тонкослойных препаратов на слайдах любого типа и покрытия.

Технология ЦЦ позволяет:

~работать с живыми клетками или осуществлять любые способы их фиксации;

~использовать любые объемы проб и концентрации клеток;

~применять различные методы регулировки плотности клеток на слайде;

~удалять мешающие микроскопии факторы;

~создавать от 1 до 8 зон для исследования на одном слайде;

~регулировать влажность препарата при помощи специальных фильтр-вставок;

~применять любые способы окраски или внесения зондов и иммунохимических маркеров.

(Продолжение следует)

16

Справочник заведующего КДЛ / № 5 май 2009

Преаналитические технологии в современных цитологических исследованиях*

В.А. Крюкова

ведущий эксперт Отдела преаналитики и клинической биохимии ООО “ОМБ”

Взятие биоматериала для цитологического исследования, как правило, проводится вне лаборатории. В настоящее время используют три основных варианта получения цитологической пробы для лабораторного исследования.

Традиционный способ для соскобов, отпечатков и препаратов тонкоигольной биопсии. Проба, взятая специальным инструментом (щеткой, шпателем, тампоном, иглой для тонкоигольной биопсии), наносится на предметное стекло. Рекомендуется провести фиксацию препарата на месте, используя специальный закрепляющий спрей или аэрозоль, чтобы избежать разрушения клеток при транспортировке. Однако такой способ не всегда позволяет получать тонкослойный препарат и имеет ряд недостатков.

а)

б)

в)

Рис. 1. Технологии нанесения клеток на слайд в жидкостной цитологии: а) осаждение на фильтр + отпечаток, б) очищение и концентрирование + пассивная седиментация в цитокамере, в) цитоцентрифугирование

Традиционный способ для биологических жидкостей (транссудатов, экссудатов, лаважей, смывов, мочи, ликвора). Исходный жидкий биоматериал отбирают в герметичный транспортный стерильный контейнер и доставляют в лабораторию. В настоящее время вопрос об объеме жидкого биоматериала для цитологического исследования и выборе транспортной среды или стабилизатора диагностическими лабораториями решается по-разному, в зависимости от типа пробы и применяемых методов. Для биоматериала с высокой концентрацией клеток возможно использование закрытых вакуумных технологий и пробирок со специальными стабилизаторами клеточных элементов (моча, ликвор, выпоты, асцитическая жидкость, лимфа).

Новые методы жидкостной цитологии (ЖЦ), в основе которых – создание разведенной клеточной суспензии из взятого биоматериала.

* Начало см.: Справочник заведующего КДЛ. 2008. № 9.

35

Оснащение современной лаборатории

Клеточный материал соскобов, отпечатков и препаратов тонкоигольной биопсии смывают с инструмента в специальную жидкую среду (в ряде случаев часть устройства для взятия проб оставляют внутри контейнера, чтобы избежать потерь клеток). Проба в герметичном контейнере доставляется в лабораторию для последующей обработки. Предложено несколько новых вариантов технологий нанесения клеточного материала на слайд*, которые позволяют автоматизировать преаналитические процессы ЖЦ (рис. 1).

Производителями предлагаются реагенты для стабилизации жидких цитологических проб, которые могут не только сохранять клетки, но и разрушать белки и слизь, улучшая качество препарата. Многие смеси разработаны для одновременной фиксации клеточных элементов в объеме. Для удобства пользователей предлагаются транспортные контейнеры разного объема (20–1000 мл) с необходимым количеством стабилизатора. Транспортные контейнеры для ЖЦ могут поставляться в комплекте с другими материалами для взятия проб (в удобной для клинициста форме) (рис. 2).

Рис. 2. Комплект для гинекологического PAP-скрининга

Производители закрытых автоматизированных систем ЖЦ используют собственный оригинальный тип транспортного контейнера специальной конструкции, содержащего стабилизатор. Транспортная система в этом случае является неотъемлемой частью технологии производителя, разработана специально для конкретного оборудования и имеет специальные конструктивные элементы.

Для открытых автоматизированных систем ЖЦ могут быть использованы разные типы транспортных контейнеров и стабилизаторов.

Оборудование для обработки цитологических проб

на преаналитическом этапе

Основными процессами обработки проб в ЖЦ, предшествующими нанесению клеток на слайд-препараты, окрашиванию препарата или введению меток, являются: перемешивание проб, разделение клеток на фракции, осветление суспензии, концентрирование или разведение.

Для перемешивания используют горизонтальные шейкеры, работающие в медленном режиме. Возможны и другие способы перемешивания, но всегда следует учитывать, что они должны минимально травмировать клеточные элементы. Перемешивание является важной операцией, и его следует обязательно проводить на всех этапах преаналитической подготовки проб, чтобы избежать потери материала для исследования.

Разделение клеток на фракции используется для отдельных типов исследований

итребует применения специального оборудования и материалов. Оно может быть

*Предметное стекло микроскопа, англ.

36

Справочник заведующего КДЛ / № 5 май 2009

выполнено в системе проточного ци-
тофлуориметра, при помощи градиен-
тного или фильтрационного центри-
фугирования.
Концентрация клеток в жидкой
цитологической пробе может сущес-
твенно отличаться. При помощи не-
фелометрии проводится оценка
плотности клеточной суспензии и по
результатам выполняется концентри-
рование или разведение раствора до
необходимого уровня. В цитологи-
ческих исследованиях также исполь-
зуются автоматические системы
аликвотирования проб, которые пе-
реносят жидкую цитологическую
пробу из контейнера в пробирку для	Рис. 3. Тонкослойные слайд-препараты,
последующей обработки или прове-	полученные методом цитоцентрифугиро-
дения других видов диагностического	вания

исследования.

Центрифуги разного типа являются необходимым оборудованием для проведения цитологических исследований. Они используются как для традиционного способа концентрирования цитологических проб в стандартных сосудах и пробирках, так и для специальной обработки проб (градиентное и фильтрационное центрифугирование). В настоящее время активно развивается новое направление в применении центрифуг в цитологических исследованиях, получившее название “цитоцентрифугирование” (ЦЦ).

ЦЦ – метод осаждения клеточных элементов из суспензии на слайд во время центрифугирования в специальной цитокамере (рис. 3).

При ЦЦ получают тонкослойные высококачественные препараты для микроскопии и других видов цитологических исследований. ЦЦ является гибкой технологией, адаптируемой к конкретным методам цитологического исследования на основе фиксированных в объеме и нефиксированных клеточных суспензий. ЦЦ проводят в виде коротких сеансов по 2–10 мин при небольших значениях ОЦС* (от 300 до 800 g при разных методах и в разных системах), чтобы избежать травмирования клеток. Центрифуга для ЦЦ должна стабильно работать в подобном режиме и иметь эффективную систему воздушного охлаждения, т. к. центрифугируются объекты со сложной формой, вызывающие повышенное сопротивление воздуха.

В настоящее время для ЦЦ производители предлагают как центрифуги специальной конструкции (цитоцентрифуги), так и специальные цитороторы или цитоподвески для комплектации универсальных лабораторных центрифуг (рис. 4). Выбор системы зависит от объема и организации работы лаборатории. Универсальные центрифуги со съемными подвесками позволяют центрифугировать как цитокамеры, так

ипробирки разного размера. Такой вариант очень удобен для экспресс-лабораторий,

*Относительная центробежная сила.

37

Оснащение современной лаборатории

			т. к. дает возможность более эффективно
			использовать в работе одну центрифугу
			с комплектом разных подвесок. Специали-
			зированные цитороторы (рис. 5) позволяют-
			за один цикл обработать большее число
			проб, поэтому они более удобны для спе-
			циализированной цитологической лабора-
			тории.
			Основой системы ЦЦ является цито-
			камера – специальная пластиковая конс-
			трукция сложной формы, имеющая один
			или несколько каналов для внесения жид-
			кой пробы с одной стороны и круглое или
			прямоугольное отверстие с резиновым
			уплотнителем – с другой (рис. 6). При
			сборке системы это отверстие герметично
	Рис. 4.	Центрифуга с дисковым циторо-	соединяется со слайдом. В процессе цент-
			рифугирования клетки осаждаются на от-
	тором для цитосистем c фиксаторами

	типа Clip	крытую поверхность слайда. Могут быть
		использованы разные типы слайдов в за-

висимости от диагностической задачи. После удаления жидкости из цитокамеры систему разбирают и получают слайд-препарат с четко выраженной рабочей зоной

итонким слоем равномерно нанесенных клеток. В случае применения многоканальных цитокамер, на одном слайд-препарате возможно получить несколько рабочих зон для цитологического исследования. При ЦЦ можно получать как влажные, так

исухие слайд-препараты – при помощи специальных вставок-фильтров, располагающихся между слайдом и цитокамерой.

Цитокамеры с прямоугольным каналом используют в центрифугах со специальным дисковым или барабанным циторотором. Этот тип цитокамер жестко фиксируется в конструкции ротора. Такие камеры оптимальны для жидких цитологических проб, в которых возможно быстрое пассивное оседание клеток (фиксированные

а)

б)

Рис. 5. Различные типы цитороторов с подготовленными к работе цитоподвесками и цитосистемами Хеттих: а) для цитосистем с прямым перпендикулярным каналом, б) для цитосистем с каналом, расположенным под углом к поверхности слайда)

38