РАЗБАВЛЕНИЕ СПЕРМЫ

ЦЕЛЬ ЗАНЯТИЙ. Изучить состав основных синтетиче­ских сред для разбавления спермы, методику их при­готовления, технику и правила разбавления спермы.

Объекты исследования и оборудование: свежеполученная сперма быка, барана, хряка, жеребца; дистиллированная вода, натрий ли­моннокислый трехзамещенный пятиводный; глюкоза, лактоза, фрукто­за, раффиноза пятиводная, калий фосфорнокислый однозамещенный, хелатон (трилон Б), натрия гидрокарбонат, магний сернокислый, ам­моний сернокислый, лимонная кислота, куриные яйца, свежее мо­локо коровы, пенициллин, стрептомицин, белый стрептоцид, спермо- сан-3, фарфоровая ступка с пестиком, стерильные марлевые салфет­ки, натрия хлорид, вакуум-наполнитель; мензурки или мерные ци­линдры на 50, 100, 250 и 500 мл, колбы на 100, 250 и 500 мл, во­ронки, спермоприемники, стерильные флаконы из-под пенициллина, ре­зиновые пробки к ним, баночки на 100 мл, фильтровальная бумага, пинцеты, скальпели, спиртовые тампоны, аналитические или аптечные весы с разновесами, часовые стекла, штативы для спермоприемников, смесителей и флаконов, водяная баня, термометры, микроскопы, обогревательный столик или термостат, предметные и покровные стек­ла, пипетки, щетки для рук.

Краткие методические указания. Занятия проводят в лаборатории кафедры или учебном пункте. Студентов (по 2 человека за одним столом) обеспечивают указанными выше реактивами, материалами и оборудованием. Преподаватель знакомит студентов с компонентами, входящими в состав синтетических сред, объясняет методику их при­готовления, технику и правила разбавления спермы. Затем студенты самостоятельно готовят основные синтетические среды и разбавляют сперму быка, барана, хряка, жеребца. Для разбавления спермы применяют различные синтетические и биологические среды.

Чаще используют желточные среды; состав их зависит от вида животного и температурного режима хранения спермы.

В состав желточных сред входят следующие компоненты.

Глюкоза медицинская (виноградный сахар). Белый гигроско­пический порошок сладкого вкуса; дает бесцветные растворы. Глю­коза является питательным энергетическим материалом и сохраняет электрический заряд спермиев.

Лактоза (молочный сахар). Белые кристаллы или порошок без запаха, со слабым сладким вкусом, легко растворимы в воде.

Гликокол (аминоуксусная кислота). Белый мелкокристалли­ческий порошок слабого своеобразного запаха и сладковатого вкуса.

Калий фосфорнокислый однозамещенный. Про­зрачные крупные кристаллы, иногда кристаллический порошок.

Хелатон (трилон Б) – белые кристаллы.

Натрий двууглекислый (сода двууглекислая) – белый порошок.

Магний сернокислый – бесцветные кристаллы.

Лимонная кислота – кристаллический порошок, хорошо растворим в воде.

Калий хлористый – бесцветные кристаллы.

Аммоний сульфат – бесцветный кристаллический порошок, иногда с легким желтоватым оттенком, хорошо растворим в воде.

Лимоннокислый натрий трехзамещенный, пя- тиводный. Белые кристаллы или мелкокристаллический порошок, вкус слабощелочной, обладает буферными свойствами и оказывает разностороннее влияние на спермиев — понижает набухание коллоидов, уменьшает проницаемость оболочки спермиев, нейтрализует кальций, свободные ионы которого вредно действуют на спермиев. Цитрат натрия также участвует в заключительной части дыхательного про­цесса спермиев.

Желток куриного яйца содержит 7% неокисленного ле­цитина, который предохраняет спермиев от температурного шока, способствует сохранению оболочки спермиев. Лецитин также исполь­зуется как питательное вещество, что предохраняет расходование липоидов спермиев. Желток должен быть ярко-оранжевого цвета.

Бактериостатические вещества – пенициллин, стрептомицин и белый стрептоцид – задерживают развитие микро­бов, попавших в сперму. В последнее время начали применять с этой целью специальный препарат спермосан-3.

Все медицинские препараты должны отвечать требованиям фар­макопеи IX и быть безвредными для спермиев. Хранить их необходимо в герметически закрытой темной посуде в сухом темном месте.

Для приготовления сред применяют дистиллированную или бидистиллированную воду.

Для приготовления молочных сред используют свежее молоко здоровой коровы, а для спермы жеребца – молоко кобылы. Можно также применить сухое полужирное молоко.

В среды вводят глицерин. Его используют в синтетических средах при замораживании спермы. В присутствии глицерина замерзание воды в синтетической среде происходит без образования крупных кристаллов, которые могут повреждать спермиев.

Состав сред для разбавления спермы различных ви­дов сельскохозяйственных животных. Для разбавления и хранения спермы быка применяются следующие синте­тические среды.

Среды для разбавления и кратковременного хране­ния спермы быка при 25°С. 1. Среда глюкозо-цитратно-желточная (ГОСТ 14746–69): глюкоза медицинская безводная – 3 г, натрий лимоннокислый трехзамещен­ный пятиводный – 1,4 г, желток куриного яйца – 20 мл, спермосан-3 — 75–90 тыс. ед., вода дистиллиро­ванная – 100 мл.

2. Молочно-желточная среда: свежее молоко – 100 мл, желток куриных яиц – 20 мл.

Среда для разбавления и замораживания спермы быка в форме гранул: лактоза – 11,5 г, желток куриных яиц – 20 мл, глицерин – 5 мл, спермосан-3 – 50 тыс. ед., вода дистиллированная – 100 мл.

Среда лактозо-фруктозо-раффинозо-магниево-глицерино-желточная (ЛФРМГЖ) для разбавления и замора­живания спермы быка в полипропиленовых соломинках: лактоза – 80,5 г, фруктоза – 12, раффиноза пятиводная – 19,5, магний сернокислый – 0,1 г, глицерин – 50 мл, спермосан-3 – 500–750 тыс. ед., желток куриных яиц – 200 мл, вода дистиллированная – 1000 мл.

Среды № 1 и 2 для разбавления и замораживания спермы быка в облицованных гранулах: № 1. 11%-ный раствор лактозы или сахарозы – 63 мл, желток кури­ных яиц – 30, глицерин – 7 мл; № 2. Лактоза или са­хароза – 6 г, натрий лимоннокислый трехзамещенный пятиводный – 1,4 г, глицерин – 5 мл, вода дистиллиро­ванная – 100 мл.

Синтетические среды для разбавления спермы готовят перед их применением. Можно использовать среды из сухих заготовок, выпускаемые медицинской промышлен­ностью; в их состав входят все указанные выше компо­ненты.

Среды для разбавления и хранения спермы барана в течение 24 ч при температуре 2 – 5°С. 1. Среда глюкозо-цитратно-желточная: вода дистиллированная – 100 мл, глюкоза медицинская безводная – 0,8 г, натрий лимон-нокислый трехзамещенный пятиводный – 2,8 г, желток куриных яиц – 20 мл, спермосан-3 — 25– 30 тыс. ед.

2. Глюкозо-фосфатная среда для разбавления и ис­пользования спермы барана в течение 2 – 3 ч; вода дис­тиллированная – 100 мл, натрий фосфорнокислый двух- замещенный 12-водный – 2,08 г, калий фосфорнокислый однозамещенный– 0,08, глюкоза медицинская безвод­ная– 3,2 г.

При проведении работы в пункте с температурой воздуха ниже 18°С добавляют на 100 мл среды 20 мл желтка куриных яиц.

Среды для разбавления спермы жеребца

Реактивы	Глюкозо- желточная	Лактозо- желточная	Молочно- желточная
Вода дистиллированная, мл	100	100	—
Молоко, мл	—	—	100
Лактоза, г	—	11	—
Глюкоза медицинская безводная, г	7	—	—
Желток куриных яиц, мл	0,8	0,8	20
Спермосан-3, тыс. ед.	30	30	30

Для осеменения кобыл используют сперму как свеже- разбавленную, так и сохраненную в разбавленном виде при температуре 2 — 5°С в течение 48 ч.

Среды дЛя разбавления и хранения спермы хряка при температуре 16 — 20°С. 1. Глюкозо-хелато-цитратно-суль- фатная среда (ГХЦС) (ГОСТ 17637—72): вода дистил­лированная (ГОСТ 6709—53) — 1000 мл, глюкоза меди­цинская (ГОСТ 6038—51) — 40 г, трилон Б (хелатон-3) химически чистый или ЧДА (ГОСТ 10652—63) — 2,6, натрий лимоннокислый трехзамещенный (ГОСТ 3161 — 57) —3,8, аммоний сернокислый очищенный (ГОСТ 10873—64) — 1,8, натрий двууглекислый (ГОСТ 4201 — 66) — 0,5 г, спермосан-3 (ВТУ 117—67) — 250—300 тыс. ед. 2. Глюкозо-хелато-цитратная среда (ГХЦ): вода дис­тиллированная — 1000 мл, глюкоза — 60 г, трилон Б (хе­латон-3) — 3,7, натрий двууглекислый — 1,2, натрий ли­моннокислый трехзамещен-ный пятиводный — 3,56 г, спермосан-3 — 250 — 300 тыс. ед.

В случае необходимости хранения спермы хряка при более низкой температуре (но не ниже 6°С) к средам ГХЦС и ГХЦ добавляют 3 — 4% желтка куриных яиц. Такую среду называют глюкозо-хелато-цитратно-сульфатно-желточной (ГХЦСЖ) или глюкозо-хелато-цитратно-желточной (ГХЦЖ).

С целью увеличения объема спермы хряка без ее хранения используют глюкозо-солевой раствор, а также свежее прокипяченное молоко от здоровых коров.

Глюкозо-солевой раствор (заполнитель): вода дистил­лированная — 1000 мл, глюкоза медицинская, безвод­ная—30 г, натрия хлорид — 4,5 г.

Приготовление синтетических сред. Г л ю к о з о- цитратно-желточная среда для спермы быка и барана. В чистую, стерильную химическую колбу наливают необходимый объем дистиллированной (бидистиллированной) воды, закрывают ее стерильным бумажным или полиэтиленовым колпачком, кипятят, а потом остужают до температуры 35°С. На аналитических или технохимических весах точно отвешивают согласно рецепту глюкозу и натрий лимоннокислый, высыпают их в другую стерильную колбу. В стерильном измерительном цилиндре или мензурке отмеривают необходимое коли­чество остуженной до 35°С дистиллированной воды и вливают ее в колбу с реактивами. Размешивают компо­ненты в воде до полного их растворения. Среду фильт­руют и стерилизуют в водяной бане 5 — 10 мин с момента закипания воды, охлаждают до 35°С, добавляют в нее спермосан-3 и желток свежих куриных яиц.

Яйца перед извлечением из них желтков тщательно моют, насухо вытирают марлевой салфеткой и обеззара­живают скорлупу спиртовым (70%-ным) тампоном или ультра-фиолетовыми лучами в настольной бактерицидной камере в течение 10 — 15 мин. Стерильным скальпелем или пинцетом яйцо раскалывают пополам и сливают белок в чашку. Желток осторожно переносят на сте­рильный лист фильтровальной бумаги. Чтобы освободить­ся от остатков белка, фильтро-вальную бумагу с одного конца несколько приподнимают и скатывают желток к ее краю. После этого прокалывают оболочку желтка сте­рильным скальпелем и, слегка сжимая фильтр снаружи, сливают желток в стерильную мензурку. Необходимое количество желтка вносят в колбу с растворенными в ней компонентами и тщательно размеши-вают. Один желток куриного яйца имеет массу 10 — 20 г.

Приготовленную синтетическую среду помещают в термостат или водяную баню температурой 30 — 35°С и в теплом виде используют для разбавления спермы. Срок использования среды не должен превышать 3 — 4 ч с мо­мента ее приготовления.

Молочно-желточная среда для спер­мы быка. Берут свежевыдоенное молоко от здоровых коров (через 2 мес после отела и не позже 30 дней до запуска), процеживают через два слоя стерильной марли в чистую стеклянную колбу, ставят на нагрева­тельный прибор и доводят до кипения. Затем молоко вновь процеживают через стерильную марлю, охлажда­ют до 30—35°С и на каждые 100 мл среды добавляют по 20 мл желтка свежих куриных яиц.

Глюкозо-фосфатная среда для спер­мы барана. В чистую и высушенную колбу согласно рецепту всыпают отвешенные натрий и калий фосфорно­кислые, глюкозу и смешивают их между собой. Отмеряют точно нужное количество дистиллированной воды и вли­вают ее в посуду с сухими веществами. После растворе­ния всех веществ колбу закрывают стерильным бумаж­ным колпачком и используют среду в теплом виде для разбавления спермы.

Глюкозо-желточная и лактозо-жел- точная среды для спермы жеребца. Со­гласно рецепту отвешивают глюкозу или лактозу и вы­сыпают в чистую сухую стерильную колбу. Вливают в нее необходимое количество прокипяченной и остуженной дистиллированной воды, фильтруют, добавляют асептиче­ское вещество и желток куриных яиц.

Молочно-желточная среда для спер­мы жеребца. Для приготовления молочно-желточной среды берут свежевыдоенное молоко кобылы или коровы. Способ приготовления этой среды такой же, как и мо­лочно-желточной среды для разбавления спермы быка.

Глюкозо-хелато-цитратно - сульфат­ная (ГЭЦС) и глюкозо-хелато-цитрат- ная (ГХЦ) среды для разбавления спермы хряка. В чистую химическую колбу нали­вают требуемый объем прокипяченной дистиллированной воды, добавляют к ней все компоненты согласно рецепту, за исключением асептических веществ, и размешивают. Закрыв колбу бумажным колпачком, среду кипятят в водяной бане 5 — 10 мин, охлаждают до 35 — 40°С и добав­ляют спермосан-3 в количестве 250 — 300 тыс. ед. на 1000 мл или антибиотики со стрептоцидом.

Глюкозо-солевой раствор для спер­мы х р я к а. В чистую сухую колбу высыпают нужное количество глюкозы и химически чистого натрия хлорида, вливают в нее необходимый объем прокипяченной и ос­туженной до 35°С дистиллированной воды. Раствор тща­тельно размешивают и используют в теплом виде.

Для приготовления синтетической среды, используе­мой при замораживании спермы, в чистую, стерильную химическую колбу наливают необходимый объем про­кипяченной дистиллированной воды. На аналитических весах точно отвешивают согласно рецепту нужные ком­поненты (кроме спермосана, глицерина и желтка) и высыпают их в колбу с водой. Размешивают компоненты до полного растворения. Затем среду стерилизуют в во­дяной бане 5 — 10 мин с момента закипания в ней воды, охлаждают до 35 — 40°С и добавляют спермосан, желток или глицерин.

Техника разбавления спермы. Перед разбавлением температура сред и спермы должна быть одинаковой, чтобы предупредить температурный шок спермиев. Для этого посуду со средой нагревают в термостате или водя­ной бане до 30 — 35°С.

Разбавляют сперму после получения и ее оценки. Работу по разбавлению спермы проводят в специальной стерильной камере или в лаборатории, облученной бак­терицидными лампами БУВ-30 или БУВ-60. Перед раз­бавлением определяют объем спермы.

Сперму быка разбавляют в градуированном смесителе или мензурке. Сперму барана после определения объема разбавляют обычно в спермоприемнике или стерильном флаконе из-под антибиотиков, сперму жеребца и хряка — в стерильных колбах.

Для разбавления допускается сперма быка с актив­ностью спермиев не ниже 8 баллов и концентрацией в 1 мл не менее 800 млн. спермиев. Сперму быка раз­бавляют в 10 — 20 — 50 раз и более.

После разбавления при использовании всех способов хранения спермы в 1 мл разбавленной спермы быка должно содержаться не менее 15 млн. спермиев с актив­ным прямолинейно-поступательным движением — 4 бал­ла (40%).

Вначале сперму быка разбавляют непосредственно в спермоприемнике 1:1 — 1:2 и после 5—10-минутной выдержки разбавляют дополнительно до нужного объема в градуирован-ном смесителе.

Сперму барана разбавляют только густую с актив­ностью спермиев не ниже 9 баллов. В зависимости от концентрации сперму барана разбавляют в 2 — 4 раза (1:1, 1:3) с концентрацией в дозе не менее 80 млн. спер­миев с прямолинейно-поступательным движением.

Сперму хряка разбавляют средами при активности спермиев не ниже 8 баллов с содержанием в 1 мл не ме­нее 100 млн. спермиев. Разбавляют сперму в 2 — 10 раз через 30 — 60 мин после ее получения. Вначале сперму разбавляют в 2—3 раза, а затем перед осеменением маток в такой степени, чтобы после разбавления в 1 мл ее содержалось не менее 30 млн. спермиев, а в дозе — не менее 3 млрд. спермиев.

Сперму жеребца допускают к разбавлению с оценкой не ниже 6 баллов с концентрацией не менее 150 млн. спермиев в 1 мл спермы. Разбавляют в 3 — 4 раза (1:2, 1:3) с концен-трацией в дозе не менее 3 млрд. спермиев.

Сперму средой разбавляют постепенно. Для этого сре­ду приливают к сперме небольшими порциями и осто­рожно смешивают после добавления каждой порции сре­ды. Разбавленную сперму обязательно проверяют под микро-скопом на активность спермиев.

При использовании градуированного смесителя раз­бавленную в спермоприемнике сперму быка в 2 или 3 раза переливают в смеситель и к ней небольшими пор­циями по стенке добавляют разбавитель. После добавле­ния каждой порции разбавителя смеситель закрывают пропарафиниро-ванной корковой пробкой и придают ему горизонтальное положение. Вращая в руках смеситель с разбавленной спермой, равномерно ее смешивают с раз­бавителем. Так повторяют несколько раз, пока не будет разбавлена сперма до нужного объема.