методички для заочников / Люминесценция

ми грибками. При введении в организм некоторых гидрофобных порфиринов

(гематопорфирина и его производных) эти соединения избирательно накапли-

ваются в опухолевой ткани. Под действием возбуждающего порфирины света наблюдается красная флюоресценция опухолей. Это явление используется для визуального распознавания опухолей кожи, а с помощью эндоскопической тех-

ники - опухолей трахеи, бронхов, желудочно-кишечного тракта и др. Свойст-

вом накапливаться в опухолях обладает также тетрациклин, флюоресценция которого в опухоли в несколько раз выше, чем в окружающих ее тканях. Эту особенность используют в ряде случаев для того, чтобы отличить опухолевое поражение желудка от воспалительного или язвенного, при которых подобного роста флюоресценции не наблюдается.

Если в локтевую вену человека ввести несколько миллилитров раствора флюоресцеина, то через несколько секунд ярко-зеленую флюоресценцию мож-

но наблюдать в тканях глаза, слизистой оболочке рта и на губах. Данный метод можно использовать, например, для определения скорости кровотока.

Флуоресцентные характеристики фитопланктона используются для опе-

ративного определения концентрации хлорофилла, на основе которой рассчи-

тывается биомасса и продуктивность водорослей. Измерение концентрации хлорофилла позволяет получить сведения о фотосинтетической активности микроводорослей, что важно для питания некоторых видов животных.

Люминесцентная дефектоскопия позволяет обнаружить дефекты обрабо-

танных поверхностей — мельчайшие щели, раковины деталей машин, свароч-

ных швов и пр. Для этого исследуемую поверхность изделия покрывают жид-

ким люминофором. Через 10-20 мин поверхность обмывают и протирают. Од-

нако в трещинах люминофор остается. Его свечение при ультрафиолетовом об-

лучении отчетливо обрисует конфигурацию трещин или повреждений. Люми-

нофоры с различной длительностью послесвечения используются для покрытия экранов кинескопов, осциллографических трубок, сцинтилляционных счетчи-

ков и т. п. Например, при изготовлении рентгеновских экранов применяют цинккадмийсульфидные люминофоры, способные к рентгено-люминесценции.

9

3. Развитие люминесцентной микроскопии

Люминесцентная микроскопия - метод микроскопии, позволяющий на-

блюдать первичную или вторичную люминесценцию микроорганизмов, клеток,

тканей или отдельных структур, входящих в их состав. Различают собственную

(первичную) люминесценцию, наблюдаемую без окрашивания, и вторичную

(наведённую), которая возникает после обработки химическим агентом или красителем.

Цвет люминесценции, т.е. длина волны излучаемого света, зависит от хи-

мической структуры и от физико-химического состояния микроскопируемого объекта, что и обусловливает возможность использования люминесцентной микроскопии в целях микробиологической и цитологической диагностики, для дифференцирования отдельных компонентов клеток. Первичная люминесцен-

ция присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1, некоторые анти-

биотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол).

Вторичная, или наведённая, люминесценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями - флюорохро-

мами, что позволяет проводить люминесцентно-цитологический и люминес-

центно-цитохимический анализ.

В истории развития люминесцентной микроскопии выделяют несколько этапов, связанных с усовершенствованием методики.

Люминесцентная микроскопия появилась в начале прошлого века как разновидность ультрафиолетовой микроскопии. В 1910 году А. Кёллер доказал принципиальную возможность создания люминесцентного микроскопа. В 1911г. изобретён люминесцентный микроскоп, который был использован рус-

ским ботаником М.С. Цветом для изучения люминесценции хлорофилла расти-

тельных клеток. Прогресс люминесцентной микроскопии в дальнейшем был связан с введением в практику флуоресцентных красителей, так называемых

10

флуорохромов, которые были разработаны Хайтингером и его сотрудниками в

1935 году. Применение сильно разбавленных растворов флуорохромов, избира-

тельно связывающихся с определёнными структурами клеток, и прежде всего акридинового оранжевого, было введено Штруггером в 1940 году. Происходи-

ло и усовершенствование аппаратуры (разработка метода возбуждения люми-

несценции падающим светом через объектив микроскопа с использованием ин-

терференционной светоделительной пластинки), разработка новых люминес-

центно-цитохимических методов, изыскание новых областей их применения,

нашедших широкое применение в микробиологии, иммунологии и других об-

ластях медико-биологических исследований.

В настоящее время различают несколько типов люминесцентной микро-

скопии в зависимости от характера освещения.

При освещении объекта проходящим светом (обычный путь освещения)

имеют дело со светопольной люминесцентной микроскопией.

В случае освещения объекта сверху - имеют дело с люминесцентной мик-

роскопией в падающем (отражённом) свете.

Собственная (первичная) люминесценция присуща только некоторым структурам в исследуемых микроскопических препаратах. Большинство ве-

ществ биологического происхождения имеет весьма слабую голубую, синюю или фиолетовую люминесценцию (максимумы в спектрах люминесценции мно-

гих из них лежат в ультрафиолетовой области спектра), поэтому возбуждать люминесценцию биологических объектов необходимо ультрафиолетовым све-

том, а в качестве «запирающего» светофильтра выбирать такой, который отсе-

кает только ультрафиолет.

Природными люминесцирующими веществами растительной клетки яв-

ляются хлорофилл, порфирин, фикоэритрин, а также клетчатка, пектин, хитин.

У высших растений наблюдается свечение пластид.

С помощью флуоресцентной микроскопии возможно определение содер-

жания витаминов в образцах, благодаря их собственной флуоресценции и с применением флуорохромов. Во многих случаях этот метод даёт лучшие ре-

11

зультаты, чем самый тонкий химический анализ, не позволяющий, например,

судить о распределении витаминов в органах и тканях. В связи с этим метод особенно широко применяется в медицине и физиологии животных и человека.

Благодаря особо высокой чувствительности люминесцентной микроско-

пии, этот метод широко применим в практике ветеринарно-санитарной экспер-

тизы санитарно-эпидемиологического контроля (например, рис. 4,5).

Рис. 4. Люминесцентная микрофотография культуры клеток амниона человека,

зараженных вирусом кори: зоны локализации вирусного антигена обладают зе-

леноватым свечением, на черно-белой фотографии это яркие пятна (метод флюоресцирующих антител).

Люминесцентные методы позволяют обнаружить стомиллиардные доли грамма вещества, что во много раз превышает чувствительность химических методов. Это позволяет использовать люминесцентный анализ для определения начальной стадии порчи продуктов, а также выявить фальсификаты, в том чис-

ле и среди фармацевтических препаратов, следовательно, предотвратить отрав-

ления и лжелечение. Некоторые данные по люминесценции фармацевтических препаратов и пищевых продуктов представлены в Приложении в таблицах 1 и 2

соответственно.

12

Рис. 5. Люминесцентная микрофотография макрофага, внутри которого видны фагоцитированные бактерии, излучающие красное свечение, на черно-белой фотографии это яркие пятна (обработка акридиновым оранжевым).

II.ОПИСАНИЕ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО МИКРОСКОПА

1.Назначение люминесцентного микроскопа «Микромед»

Микроскоп люминесцентный предназначен для исследования и наблюде-

ния микробиологических, гистологических и других объектов в свете их види-

мой люминесценции, возбуждаемой зелено-сине-фиолетовым участком спек-

тра, а также ультрафиолетовыми лучами с длиной волны более λ=410 нм.

Микроскоп позволяет наблюдать и фотографировать изображение объек-

та в свете видимой люминесценции при освещении сверху, через опак-

иллюминатор и объектив, при освещении проходящим светом через конденсор микроскопа. При работе в проходящем свете в светлом поле микроскоп может быть использован в различных областях медицины (гематологии, дерматоло-

гии, урологии, пульмонологии и др.) при диагностических исследованиях в клиниках и больницах, а также для исследования пищевых продуктов. На мик-

роскопе можно изучать окрашенные и неокрашенные биологические объекты в виде мазков и срезов. Микроскоп безопасен для жизни и здоровья исследовате-

13

ля и окружающей среды и соответствует требованиям международных стандар-

тов.

Микроскоп рассчитан на эксплуатацию в районах с умеренным и холод-

ным климатом в помещении при температуре воздуха от +10оС до +35оС. Его необходимо устанавливать в затемненном помещении, где нет вибрации, отсут-

ствуют пыль и пары агрессивных реактивов.

2. Технические данные микроскопа «МИКРОМЕД»

Спектральный диапазон возбуждения люминесценции, нм…. от 410 до 550

Спектральный диапазон исследуемом люминесценции, нм…..от 515 до 700

Наименьшее увеличение микроскопа ………………………….40

Наибольшее увеличение микроскопа …………………………..1000

Линейное увеличение объективов ………………………………4, 10, 40, 100

Увеличение окуляров …………………………………………….10

Линейное поле зрения в пространстве изображений, мм ………22

3. Оптическая схема люминесцентного микроскопа

Оптическая схема люминесцентного микроскопа представлена рис. 6.

Свет от источника (ртутная лампа) 1 попадает через теплозащитный фильтр 2,

запирающий фильтр 3 и полевую диафрагму 4 к возбуждающему фильтру 5.

Этот фильтр встроен в рефлекторную задвижку, в которой также расположен дихроичный светоделитель 6. Дихроичный светоделитель отражает коротко-

волновое возбуждающее излучение через объектив 7 на препарат 8. Испускае-

мый при этом свет собирается объективом 7 и пропускается светоделителем 6,

т.к. он обладает большей длиной волны, чем возбуждающий свет. Затем лучи проходят через эмиссионный фильтр 9, где отфильтровывается остаточный возбуждающий свет. Вследствие этого такой фильтр называют запирающим фильтром. Тубусная линза 10 и окуляр 11 формируют микроскопическое изо-

бражение, теперь состоящее только из люминесцентного света.

14

Рис. 6. Оптическая схема люминесцентного микроскопа

4.Устройство микроскопа «Микромед»

Всостав люминесцентного микроскопа «Микромед» (рис. 7) входят: шта-

тив с фонарями источников света, револьверным устройством крепления объ-

ективов, предметным столиком и конденсором; бинокулярная или тринокуляр-

ная насадка; источник питания ртутной лампы; комплект объективов, окуляров и светофильтров.

Принцип действия микроскопа основан на использовании явления люми-

несценции наблюдаемых объектов, возникающей под действием света опреде-

ленного спектрального состава. Освещение объектов для возбуждения люми-

несценции производится сверху через опак-иллюминатор и объектив микро-

скопа. Источником света является ртутная лампа. Свет, необходимый для воз-

буждения люминесценции, выделяется из общего излучения ртутной лампы с помощью светофильтров, условно называемых светофильтрами возбуждения. В

объектив свет направляется светоделительной пластиной с интерференцион-

15

ным покрытием, преимущественно отражающим свет возбуждения и пропус-

кающим свет люминесценции объекта.

Для лучшего спектрального разделения света возбуждения и света люми-

несценции объекта, а также повышения контраста изображения применяется светофильтр, который поглощает рассеянный в микроскопе свет возбуждения и пропускает в систему наблюдения только свет люминесценции объекта. Све-

тофильтр возбуждения, светоделительная пластина и отрезающий (запираю-

щий) светофильтр объединяются в блок.

Рис. 7. Внешний вид микроскопа

16

Рис. 8. Устройство и органы управления люминесцентного микроскопа «Микромед». 1 - защитный экран; 2 - револьверное устройство; 3 - объективы; 4 - предметный столик; 5 - конденсор Аббе; 6 - осветительное устройство проходящего света с регулируемой полевой диафрагмой; 7 - выключатель галогенной лампы; 8 - рукоятка регулировки яркости лампы; 9 - штатив; 10 - рукоятка грубой фокусировки; 11 - рукоятка тонкой фокусировки; 12 - рукоятка перемещения предметного столика в двух взаимно-перпендикулярных направлениях.

В люминесцентной микроскопии препараты обрабатываются специаль-

ными реактивами, отдельные молекулы которых обладают способностью на

очень короткое время, как правило, доли секунд – поглощать свет, а затем сно-

ва испускать его. Этот испускаемый свет имеет смещение по длине волны в

сторону длинноволновой области спектра (красный цвет). Так, например, если

поглощается синий свет, то сразу после этого испускается зеленый свет. Зеле-

17

ный свет преобразуется в желтый, желтый – в красно-оранжевый, а невидимое ультрафиолетовое излучение – в видимый свет.

Рис. 9. 1 - фонарь ртутной лампы; 2 - корпус люминесцентной насадки; 3 - окуляры; 4 - тринокулярная насадка.

Важно (См. рис. 7): Положение рукоятки под символом «N», предназна-

чено для работы в проходящем свете по методу светлого поля или других мето-

дов контрастирования при условии применения соответствующих устройств

(например устройства для наблюдения по методу фазового контраста).

Положение рукоятки под символом «G», (GREEN-зеленый) означает, что включенный в ход лучей блок из общего излучения источника света (250÷900

нм) для возбуждения люминесценции выделяет монохроматическое излучение

515÷550 нм (зеленая область спектра), а наблюдение свечения элементов объ-

екта (в отраженном свете) после прохождения через запирающий светофильтр производится в области 595÷700 нм, что соответствует оранжево-красному цве-

ту.

18