методички для заочников / Люминесценция

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Пятигорская государственная фармацевтическая академия»

КАФЕДРА ФИЗИКИ И МАТЕМАТИКИ

В.Т. Казуб, Н.Н. Семёнова

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ АНАЛИЗ

Методические указания для студентов 2 курса по дисциплинам С2.Б.2 - «Физика» (очная и заочная форма обучения) и

С3.В.ОД.3- «Физические основы технологических процессов и методов фармацевтического анализа» (очная и заочная форма обучения)

Пятигорск 2011

УДК 535.37:543.426 (078) ББК 22.535 я 73

Рецензент: к. ф.-м. н., доцент кафедры информатики и математики ГОУ ВПО Пятигорского филиала Российского государственного торгово-экономического университета Болгова Ю. А.

В.Т. Казуб, Н.Н. Семёнова

Люминесценция: методические указания к лабораторным занятиям по физике, физическим основам технологических процессов и методам фармацевтического анализа для студентов 2 курса очного и заочного отделений/ В.Т. Казуб, Н.Н. Семёнова. – Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2011. – 21 с.

Методические указания составлены в соответствии с программой по физике для студентов фармацевтических вузов и содержит теоретический материал по теме «Люминесцентный анализ», раздел, посвященный практическому использованию явления люминесценции в науке и технике, а также описание люминесцентного микроскопа с практическим заданием к лабораторной работе.

В приложении представлены краткие сведения по люминесценции некоторых фармацевтических препаратов и пищевых продуктов.

УДК 535.37:543.426(078) ББК 22.345 я 73

Допущено к внутривузовскому изданию Председатель ЭМС Проф. В.В. Гацан

Протокол №

от

2011 г.

© Пятигорская государственная фармацевтическая академия, 2011

I.ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ

1.Фотолюминесценция и её применение

Все тела, которые мы наблюдаем, являются источниками видимого электромагнитного излучения.

Шкала электромагнитных волн представлена на рис. 1.

Рис. 1. Шкала электромагнитных волн

Видимый свет – это электромагнитные волны с длиной волны в интер-

вале (380÷750)∙10-9м = 380÷750 нанометров (нм).

В шкалу электромагнитных волн включены и невидимые излучения – инфракрасное - ИК, ультрафиолетовое - УФ, гамма и рентгеновские лучи (табл. 1).

Невидимые лучи

Ультрафиолетовые

(120÷380) нм

Видимые лучи

Фиолетовый	Синий	Голубой	Зеленый	Желтый	Оранжевый	Красный

(380÷750) нм

Таблица 1

Невидимые лучи

Инфракрасные

(750÷2000) нм

В области видимого света излучение определенной длины волны (моно-

хроматический свет) воспринимается нашим глазом как излучение определен-

ного цвета (красного, желтого, голубого, и т.д.). Но в быту мы чаще имеем дело

не с монохроматическим светом, а со сложным, состоящим из различных длин волн.

Для характеристики излучения, сложный свет разлагают по длинам волн,

например при помощи призм, и получают соответствующий спектр, свойствен-

ный данному источнику света (например, спектр ртутной лампы, спектр лампы накаливания).

Если на пути лучей от источника света к призме поместить вещество, по-

глощающее свет, и наблюдать спектр прошедшего света, то мы получим спектр поглощения этого вещества. Так как свет различных длин волн поглощается неодинаково, то можно подобрать вещества, которые будут избирательно по-

глощать свет определенной длины волны. На этом явлении основано действие светофильтров. Так, например, для люминесцентного анализа чаще всего упот-

ребляется так называемый черный вудовский фильтр, изготовляемый из стекла,

окрашенного окисью никеля. Вудовский фильтр обладает способностью по-

глощать лучи видимой части спектра и пропускать УФ лучи, главным образом длиной волны 365÷366 нм, с помощью которых можно возбуждать люминес-

ценцию изучаемой системы.

Понятие люминесценции объединяет собой все явления излучения света,

сопровождающиеся малым выделением тепла (холодный свет) по сравнению с температурным излучением раскаленных тел.

Встречающиеся в природе явления люминесценции весьма разнообразны:

к ним относится и северное сияние, и свечение бактерий, жуков, рыб, и свече-

ние искусственно приготовляемых веществ (люминофоры) и т.п.

Люминесценция наблюдается или в виде флюоресценции или в виде фос-

форесценции. Исходя из наиболее характерного качественного признака люми-

несценции – ее длительности – различают (условно) два рода люминесценции:

флюоресценцию – свечение мгновенное, позволяющее наблюдать его практи-

чески лишь в момент возбуждения светящегося предмета, и фосфоресценцию – свечение более длительное, продолжающееся иногда весьма долго по оконча-

нии возбуждения.

2

Явление люминесценции обусловлено излучением веществом света за счет ранее поглощенной энергии. Энергия может быть сообщена веществу разными путями и в разной форме. В зависимости от вида и способа ввода энергии (воз-

буждения) различают несколько видов люминесценции.

Фотолюминесценция — свечение, вызываемое лучами видимого и ульт-

рафиолетового света (например, свечение циферблата часов).

Рентгенолюминесценция — свечение под действием рентгеновских лучей

(свечение просвечивающих и усиливающих рентгеновских экранов).

Катодолюминесценция — свечение под действием пучка электронов (све-

чение экрана катодных осциллографов, экранов телевизора, радиолокатора).

Здесь в качестве люминофора, покрывающего экран, используются сульфиды и селениды цинка и кадмия.

Радиолюминесценция — свечение, вызываемое лучами радиоактивных ве-

ществ.

Электролюминесценция — свечение под действием электрического разряда

(газоразрядные трубки), электрического поля.

Триболюминесценция — свечение при трении и раскалывании кристаллов

(например, сахара).

Термолюминесценция — свечение при небольшом нагревании, вызванное отдачей ранее аккумулированной энергии (например, свечение минерала флюорита).

Xемилюминесценция — свечение, происходящее в процессе химических реакций (окисление фосфора).

Биолюминесценция — свечение, наблюдаемое у живых организмов (насе-

комых, бактерий, глубоководных рыб и др.).

Для нас наибольший интерес представляет фотолюминесценция, когда ве-

щества, поглощая лучи, сами светятся, т. е. свет, поглощенный атомами и моле-

кулами, отдается ими в виде светового же излучения.

Понятие люминесцентного свечения сформулировано С.И. Вавиловым.

Люминесценция — излучение, представляющее собой избыток над тепловым

3

излучением тела при данной температуре и имеющее длительность, значи-

тельно превышающую период световых волн.

Первая часть этого определения предложена Э. Видеманом и отделяет лю-

минесценцию от равновесного теплового излучения. Действительно, любое те-

ло, имеющее температуру выше абсолютного нуля, излучает электромагнитные волны. Это излучение является тепловым, несмотря на то, что температура тела может быть значительно ниже температуры окружающей среды. Вторая часть определения люминесценции — признак длительности — предложена Вавило-

вым для того, чтобы отделить люминесценцию от других явлений вторичного свечения — теплового, отражения и рассеяния света, тормозного излучения за-

ряженных частиц и пр. Поскольку период световых волн имеет значение по-

рядка 10-15с, то длительностью, достаточной, для того, чтобы отнести какой-

либо вид свечения к люминесценции, считается величина, значительно бóльшая чем 10-15с и выше (неограниченно).

Некоторые вещества, названные в XVII веке фосфорами, способные све-

титься под воздействием света, были открыты еще в 1600 г. В настоящее время фосфорами называют вещества, которые после прекращения облучения их све-

том продолжают светиться более или менее длительное время, другое их назва-

ние – люминофоры. Явление длительного послесвечения называют фосфорес-

ценцией. Фосфоресценция свойственна, главным образом, твердым телам. Фо-

толюминесценция, прекращающаяся практически сразу после прекращения ос-

вещения, называется флуоресценцией. Флуоресценция характерна главным об-

разом для жидкостей и газов. Естественно, что резкой границы между этими двумя явлениями нет. Таким образом, по длительности, люминесценция делит-

ся на флуоресценцию и фосфоресценцию.

Стокс установил, что излучаемый при люминесценции свет имеет бóльшую длину волны, чем свет, возбуждающий люминесценцию. Правило Стокса непо-

средственно вытекает из квантовых представлений о свете. Так как энергия па-

дающего фотона hv0 частично растрачивается на различные внутримолекуляр-

4

ные процессы, то энергия испускаемого фотона hv оказывается несколько меньше, чем hv0.

hv=hv0 - A,

где v0 – частота падающего света; v – частота излучаемого света; А– энер-

гия, рассеиваемая в веществе. Так как обычно, то υ < υ0 и > 0.

Однако если атомы (молекулы) люминесцирующего вещества находятся в возбужденном состоянии (что имеет место, например, в случае нагревания те-

ла), то к энергии возбуждающих фотонов может добавляться энергия за счет внутренних источников. В этом случае А <0, и в спектре испускания наблюда-

ется так называемая антистоксо-

ва область, для которой А > 0, то

υ > υ0 и > 0.

Рис. 2. Энергетические уровни Механизмы флуоресцен-

ции и фосфоресценции несколь-

ко отличаются друг от друга.

При флуоресценции излучение возникает вследствие того, что электрон данного атома (молекулы), возбуж-

денный падающим светом, возвращается обратно на невозбужденный энерге-

тический уровень (рис. 2). Допустим, что вследствие поглощения кванта элек-

трон перешел с невозбужденного энергетического уровня Е0 на уровень Е5 (пе-

реход I). Обратный переход возможен либо сразу на уровень Е0 (переход II),

либо в несколько этапов (переходы III—IV—V. Все варианты переходов на ри-

сунке показаны стрелками.

Все эти процессы происходят внутри атома и протекают сравнительно быстро: время затухания порядка времени жизни атома в возбужденном со-

стоянии.

Длительность фосфоресценции определяется временем пребывания элек-

трона на локальном уровне и может быть весьма большой.

5

Энергетическим выходом люминесценции называют отношение энергии люминесценции к поглощенной энергии:

Вэн = Ел/Еп

Поскольку часть поглощаемой люминофором энергии превращается в те-

пло, то величиной энергетического выхода характеризует полноту преобразо-

вания энергии возбуждения в энергию люминесценции. Согласно закону С.И.

Вавилова, энергетический выход люминесценции сначала растет пропорцио-

нально длине волны возбуждающего света, а затем, достигнув максимум, рез-

ко падает до нуля.

Кроме энергетического выхода для характеристики эффективности трансформации поглощенной люминофором энергии возбуждения введено по-

нятие квантового выхода. Квантовым выходом называют отношение числа квантов излучаемых люминофором (Nл), к числу поглощенных квантов возбуж-

дающего света (Nп):

Вкв = Nл/Nп.

В случае квантового выхода энергетические потери при стоксовском смещении спектра излучения не учитываются по отношению к спектру погло-

щения. Величина выхода зависит от состава люминофора, технологии его изго-

товления и от присутствия посторонних примесей, кроме того, квантовый вы-

ход может зависеть от условий возбуждения, длины волн и интенсивности воз-

буждающего света, а так же от температуры.

2. Применение явления люминесценции

Природные явления, связанные с люминесценцией были известны чело-

веку с давних времен: северные сияния, свечения насекомых и рыб, гнилушки в лесу и т.д. Лабораторное изучение этих явлений началось более трехсот лет на-

зад, однако исследования носили случайный характер и имели целью решение задач, не связанных с существом явления. Например, средневековые алхимики изучали люминесценцию некоторых соединений при поиске способов искусст-

6

венного получения драгоценных металлов. Отсутствие технических возможно-

стей тормозило развитие этого направления в науке. Из ранних исследований люминесценции нужно упомянуть работы русского ученого В.В. Петрова (на-

чало 19 в.), разграничившего понятия фотолюминесценции и биолюминесцен-

ции.

Сегодня явление люминесценции широко применяется и прежде всего в

осветительной технике. Фосфоры с подобранным соответствующим образом спектром излучения используются в лампах дневного света, которые очень экономичны и долговечны, в театральной технике, для декоративных целей, для изготовления украшений и как светящиеся указатели различных приборов, де-

талей одежды и др. Так как, изменяя состав люминофора, можно изготавливать лампы с различным спектром излучения (с белым, тепло-белым, холодно-

белым, дневным), то они успешно используются для «досвечивания» сельско-

хозяйственных культур, выращиваемых на защищенных грунтах (в теплицах при непродолжительном световом дне).

Так как люминесцентное излучение отражает внутреннюю структуру ве-

щества, оно может быть использовано для изучения этой структуры. Люминес-

центный анализ применяется для определения качества и чистоты различных веществ (в частности, для определения качества пищевых продуктов, годности фармацевтических препаратов, гистологических исследований), контроля за химическими превращениями, определения концентрации веществ в смесях,

оценки сортов семян и пр.

Флюоресцирующие соединения могут быть определены в очень низких концентрациях, часто в присутствии посторонних веществ. Поэтому регистра-

ция люминесценции успешно используется для количественного определения многих биологически важных веществ. Одним из наиболее ярко флюоресци-

рующих лекарственных соединений является хинин. В кислых растворах он люминесцирует в синей области (450÷475 нм). Чтобы определить его в плазме крови проводят осаждение белков метафосфорной кислотой и измеряютлюми-

несценцию хинина прямо в фильтрате. Яркой синей флюоресценцией обладает

7

противогрибковый препарат гризеофульвин, он легко определяется в экстрак-

тах из крови или мочи. Барбитураты в щелочной среде обладают яркой зеленой флюоресценцией, их можно определить в экстрактах из биологического мате-

риала. После экстракции возможна количественная регистрация многих вита-

минов, например витамина Е, максимум флюоресценции которого лежит в УФ-

области при λ=330 нм. Витамин В6 имеет синюю, а витамин А - зеленую флюо-

ресценцию.

Наркотические вещества морфин и героин флюоресцируют очень слабо,

но после обработки образцов серной кислотой с последующим выщелачивани-

ем возникает специфическая интенсивная синяя флюоресценция продуктов ре-

акции. Этим методом удается определить до 0,02 мкг наркотика в пробе.

Весьма серьезную проблему представляет анализ содержания онкогенных углеводородов в атмосферном воздухе. Загрязнение воздуха улавливают орга-

ническими растворителями, затем по сине-зеленой флюоресценции в пентане или концентрированной серной кислоте с высокой чувствительностью (до 0,001

мкг/мл) и специфичностью определяются бензпирен и другие онкогенные ве-

щества.

Чувствительным лабораторным методом определения АТФ является ре-

гистрация хемилюминесценции в присутствии люциферина и люциферазы светлячка. Люцифераза катализирует реакцию восстановленного люциферина с АТФ; продукт этой реакции - аденилат при окислении испускает свет.

По собственной люминесценции проводят контроль качества пищевых продуктов. Так, при длительном хранении молока и сливок рибофлавин окис-

ляется в люмихром, что сопровождается изменением цвета флюоресценции от желто-зеленого к синему. Яйца, зараженные некоторыми видами бактерий рода

Pseudomonas, при УФ-облучении начинают интенсивно флюоресцировать (за счет пигмента пиовердина, синтезированного этими бактериями).

Регистрацию люминесценции используют в целях диагностики. Харак-

терная первичная люминесценция желто-зеленого цвета, возбуждаемая УФ-

облучением при λ=365 нм, наблюдается в волосах, пораженных паразитически-

8