Методы экспериментальной онкологии

Классическими методами экспериментальной онкологии являются следующие:

1. Трансплантация опухоли (Новинский 1876 год у щенков, хотя идея трансплантации опухоли принадлежит Р. Вирхову);

2. Эксплантация - выращивание опухоли в культуре ткани;

3. Индукции опухоли, т.е. применением химических (Ишикава, Ямагива, Л.М. Шабад), физических и биологических канцерогенов. Так, Л.А. Зильбер, Эллерман и Банг вызвали лейкоз у кур, вводя им бесклеточный фильтрат или то же самое мышам (Гросс), либо фактор молока у новорожденных мышей - рак молочной железы.

Патогенез

Механизм канцерогенеза, включающий в себя приобретение клеткой опухолевой программы с последующим безудержным разрастанием (патологическая гиперплазия), - процесс сложный, длительный и многоэтапный. Он может тянуться десятилетиями. На первом этапе происходит превращение нормальной клетки в опухолевую, получившее наименование бластомоцитогенеза. Второй этап связан с превращением опухолевой клетки в опухолевую ткань – рак, когда идет интенсивное накопление массы опухолевых клеток (1 г опухоли содержит приблизительно 1 млрд. клеток). Этот процесс получил наименование бластомогенеза.

На первом этапе – этапе бластомоцитогенеза выделяют две стадии:

1) трансформация нормальной клетки в опухолевую, т.е. приобретение клеткой онкогенной программы. Этот этап предположительно длится от нескольких лет до нескольких десятков лет (10-30 лет).

2) активация, или промоция, когда происходит реализация онкогенной программы, которая без повторного действия канцерогена невозможна.

Чаще всего опухолевый генотип (специфическая мутация) появляется при вступлении делящейся клетки в фазу S (фаза синтеза) или M (фаза митоза).

Для объяснения механизма превращения нормальной клетки в опухолевую (т.е. трансформации обычной клетки в раковую) предложены две теории – генетическая и эпигеномная, суть которых сводится к нестабильности генома клетки и стойким и необратимым его изменениям. Неопровержимыми доказательствами верности постулируемого положения являются классические опыты с перевивкой штаммов разных опухолей. Парентеральное введение клеток таких опухолей экспериментальным животным приводит к развитию соответствующей опухоли (т.е. образованию новых, подобных себе клеток) в их организме, несмотря на то, что опухолевые клетки попадают в совершенно новую для них среду со свойственными ей иммунными, биохимическими и нейрогуморальными особенностями. Размножение опухолевых клеток с исходом в опухоль может продолжаться теоретически бесконечно. Примерами могут служить перевиваемые в течение почти 100 лет карцинома Эрлиха (с 1905 г.), саркомы Иенсена (с 1907 г.) и другие, которые после каждой трансплантации образуют себе подобные злокачественные опухоли.

Приведенные опыты показывают, что стимул к беспредельному делению клеточного материала заложен в самих опухолевых клетках, а не в окружающей их среде. Учитывая, что признаки злокачественности передаются раковыми клетками из поколения в поколение, можно считать доказанным, что признаки злокачественности закодированы в геноме самих опухолевых клеток, и, следовательно, опухолевый процесс - это болезнь генома клетки.

В настоящее время предложено большое количество теорий, пытающихся объяснить механизмы канцерогенеза. Наиболее значимыми среди них являются следующие:

1. Мутационная теория (Г. Бовери), согласно которой в основе трансформации нормальной клетки в опухолевую лежит мутация.

2. Эпигеномная теория (К. Гейдельберг с соавт.). В соответствии с данной теорией трансформация нормальной клетки в опухолевую не связана с мутациями генов, т.е. изменениями или повреждениями их структуры, а обусловлена одновременно сосуществующими репрессией генов, тормозящих деление клеток, и дерепрессией генов, стимулирующих их деление. Это естественно ведет к безудержному делению клеток и передаче их эпигеномных изменений по наследству.

3. Вирусно-генетическая теория (Л.А. Зильбер с соавт.), согласно которой опухолевая трансформация связана с внедрением в клеточный геном вирусной ДНК (или ДНК-копий вирусной РНК).

4. Теория эндогенных вирусов (Р. Хьюбнер, Г. Тодаро). По этой теории, вирусные гены, или онкогены, пребывают в клеточном геноме человека и животных в репрессированном состоянии на протяжении всей жизни организма и передаются по наследству как обычные клеточные гены. Вирусные онкогены могут быть активированы воздействием любого канцерогена, результатом чего может быть превращение нормальной клетки в опухолевую. Полагают, что эти эндогенные вирусы представляют собой бывшие экзогенные онкорнавирусы, внедрившие на ранних этапах эволюции в клеточный геном всех многоклеточных организмов. После инфицирования клеток вирусная РНК через собственную транскриптазу синтезировала ДНК-копии, оказавшиеся в геноме и оставшиеся здесь навсегда в латентном состоянии.

5. Теория образования опухолеродных генов – протовирусов (Н. Темин, Д. Балтимор). Согласно этой гипотезе при обычных нормальных условиях на матрицах РНК с помощью клеточной ревертазы происходит синтез копий ДНК, необходимой для усиления функций нормальных генов. Воздействие канцерогенов приводит к нарушению и изменениям структуры РНК-матриц, что ведет к синтезу ими мутантных ДНК-копий. Эти мутантные ДНК-копии в потенции могут становиться матрицей для образования эндогенного РНК-вируса (отсюда название для мутантных ДНК-копий – протовирусы). Последние включаются в клеточный геном и вызывают опухолевую трансформацию клетки.

6. Теория недостаточности репарации ДНК (М.М. Виленчик). Согласно этой теории клеточная ДНК даже в нормальных условиях постоянно подвергается агрессивным воздействиям со стороны экзогенных и эндогенных мутагенов, вызывающих ее повреждение и образование мутантных, в том числе опухолеродных, генов. В подавляющем большинстве случаев при этом опухолевой трансформации клеток не происходит благодаря функционированию системы репарации ДНК, устраняющей поврежденные участки нуклеотидов. Факторы, снижающие активность системы репарации ДНК, облегчают развитие индуцированных или спонтанных мутаций, в том числе и опухолевой , что способствует опухолевой трансформации клеток. Многие канцерогены действительно вызывают одновременно и повреждение нуклеиновых кислот (т.е. мутации), и снижение репарации ДНК.

7. Теория недостаточности иммунологического надзора за нормальным антигенным составом внутренней среды организма (Ф. Бернет). Согласно этой теории в организме постоянно происходят спонтанные мутации, в результате чего образуются мутантные клетки, включая опухолевые, содержащие в своем составе антигены, несущие на себе признаки генетически чужеродной информации. Клетки с такими антигенами подлежат уничтожению эффекторными механизмами иммунной системы. В условиях иммунодепрессии такие спонтанно возникшие опухолевые клетки уничтожению не подвергаются и продолжают размножаться с образованием опухоли. Угнетение активности иммунной системы (иммунодепрессия) может быть вызвано самыми различными факторами, в том числе и канцерогенными. Таким образом, канцерогенные агенты способствуют развитию опухолевого роста, выступая одновременно в двух ипостасях - как этиологические факторы и как факторы условия канцерогенеза.

8. Теория двухстадийного канцерогенеза (И. Беренблюм). Согласно этой теории в канцерогенезе выделяют две стадии:

а) индукция – состояние, наиболее вероятно связано с мутацией, что приводит к образованию латентной, дремлющей опухолевой клетки;

б) промоции – активация и размножение ранее латентной опухолевой клетки с исходом в образование опухоли.

9. Теория онкогенов вирусной и иной природы (Д. Балтимор, М. Бардацид). В семидесятые годы было установлено, что геном ретровируса (например, вируса Рауса) состоит из 4-х генов (клеточный геном человека включает в себя 35-45 тысяч генов). Каждый ген кодирует синтез определенных белков. Один из этих четырех вирусных генов оказался онкогеном, кодирующим синтез «саркомного» онкобелка, вызывающего трансформацию нормальной клетки в опухолевую (src-онкоген). На обоих концах генома ретровируса находятся участки нуклеиновой кислоты, которые повышают активность соседних генов. На хромосомах человека установлена локализация более 40 онкогенов и примерно около 100 протоонкогенов.

Если изъять из вируса Рауса src-онкоген, то вирус теряет способность индуцировать опухолевый рост как in vivo, так и in vitro, т.е. и в клеточной культуре, и при прямом его введении в клетки. В то же время клонированный src-ген сам по себе вызывает опухолевую трансформацию при прямом его введении в нормальную клетку методом микроинъекций. Аналогично геному вируса Рауса построены геномы остальных онкогенных ретровирусов. К настоящему времени обнаружены около 30 онкогенов у 20 изученных онкорнавирусов. Все вирусные онкогены принято сокращенно обозначать тремя буквами: например, V-src (V – вирус, src – саркома Рауса).

В эти же годы было установлено, что ДНК соматических клеток млекопитающих содержит участки, гомологичные (близкородственные) по нуклеотидному составу онкогену вируса саркомы Рауса – scr. Вскоре обнаружилось, что для каждого из 20 известных ретровирусных онкогенов (онкорнавирусных генов) в геноме нормальных и опухолевых клеток разных видов животных имеется свой клеточный аналог. В нормальных клетках аналог вирусного онкогена неактивен. Он был назван протоонкогеном, в отличие от опухолевой клетки, где он активен, и поэтому называется активным клеточным онкогеном, или просто клеточным онкогеном. Клеточные онкогены, по аналогии с вирусными онкогенами, обозначаются четырьмя буквами латинского алфавита, только вместо первой буквы «V» пишется буква «C» (от слова «cellular» – клеточный). Например, клеточный онкоген саркомы Рауса , по аналогии с ее вирусным онкогеном V-src, обозначается C-src. Онкогены обнаружены практически у всех эукариот – от протозоа до человека. Дополнительно в опухолях обнаружен ряд клеточных онкогенов, которые не найдены в вирусах. Например, в клетках остеосаркомы человека, трансформированной in vitro химическим канцерогеном, есть клеточный онкоген Met. Истинно клеточные онкогены, обнаруженные в опухолях, программируют их неопластическую трансформацию при введении их в клеточную культуру.

Источниками клеточных онкогенов являются клеточные протоонкогены – предшественники онкогенов. Считается также, что клеточные онкогены и их предшественники не происходят из вирусных онкогенов. Скорее, вирусные онкогены возникли из клеточных онкогенов. Так, мутантные вирусы, потерявшие свои онкогены, сохраняют способность к размножению. Следовательно, «потерявшийся» онкоген не является жизненно необходимым для онкорнавирусов. В то же время экспериментальное «изъятие» клеточных онкогенов у некоторых многоклеточных приводит к их гибели (например, разрушение ras-1 или ras-2 у дрожжевых клеток). Далее, мутантный вирус Рауса, лишенный онкогена src, вновь его «захватывает» при пассировании этих вирусов через клетки саркомы Рауса, содержащие его. Наконец, существуют клеточные онкогены, не имеющие вирусных аналогов, например, онкоген с-Met в опухоли, индуцированной химическим канцерогеном.

Таким образом, онкогены в онкорнавируса не являются исходно присущими вирусам, а «украдены» ими из генома тех клеток, в которых они побывали. Есть основания полагать, что клеточные протоонкогены, из которых непосредственно образуются клеточные онкогены, представляют собой нормальные гены, программирующие деление и созревание клеток в период эмбрионального развития плода человека. При изменении их структуры или активности под влиянием канцерогенов они превращаются в активные клеточные онкогены, вызывающие опухолевую трансформацию клеток.

Механизм превращения протоонкогенов в клеточные онкогены

Протоонкогены превращаются в онкогены под влиянием канцерогенных агентов – физических, химических, биологических (онковирусов). Возможно участие нескольких основных механизмов активации протоонкогена: включение промотора, амплификация, транслокация, инсерции, трансдукция, мутация.

Включение промотора. Промотором считается участок ДНК, с которым связывается РНК-полимераза, когда запускается синтез гена (или онкогена). Условием, необходимым для проявления активирующего действия промотора, является расположение его вблизи протоонкогена, что обеспечивало бы его взаимодействие с выше указанным протоонкогеном. Роль промоторов для протоонкогенов могли бы играть ДНК-копии определенных участков генома онкорнавирусов. Подтверждением сказанному могут служить опыты с индуцированием определенных опухолей, например, лимфомы у птиц введением ретровируса ALV, лишенного онкогена. В этом случае ДНК-копия РНК ретровируса включалась около протоонкогена c-myc, что сопровождалось увеличением транскрипции им РНК в 20-100 раз.

Роль промоторов для протоонкогенов могут исполнять мобильные генетические структуры (так называемые «прыгающие» гены), представляющие собой фрагменты или участки ДНК, способные перемещаться и встраиваться в разные участки генома клетки. Перемещающиеся генетические фрагменты – мобильные гены, обнаружены в клетках практически всех животных, включая человека. Сейчас стало известно, что мобильные гены и протовирусы (ДНК-копии онкорнавирусов) – это элементы генома, сходные между собой.

Амплификация. Под этим термином понимают приумножение числа, или образования дополнительного количества копий протоонкогенов, обладающих в норме крайне низкой, следовой активностью. Как результат такого многократного увеличения протоонкогенов общая активность последних значительно возрастает, что может привести к опухолевой трансформации. В качестве примера можно привести наблюдения над развитием промиелоцитарного лейкоза, когда дополнительное увеличение числа копий протоонкогена c-myc до 16-32 приводило к опухолевой трансформации. Еще одним подтверждением роли амплификации протоонкогенов в опухолевой трансформации клеток могут служит опыты, в которых показана возможность индукции перехода нормальной клетки в опухолевую при введении в клеточный геном большого числа (до 30) самих ДНК-копий протоонкогена c-Ha-ras.

Транслокация протоонкогена. Транслокация – это перемещение генетического материала, включая протоонкоген, по нуклеотиду в тот его участок, где располагается функционирующий промотор, который в силу своего функционального состояния превращает неактивный протоонкоген в активный. Транслокации онкогенов как правило сопутствуют хромосомные аберрации. Наиболее известно в этом отношении появление хромосомной аберрации при хроническом миелолейкозе, при котором обнаруживается реципрокная транслокация генетического материала 9 и 22 пар хромосом, сопровождающаяся укорочением одной из хромосом 22 пары, получившей наименование филадельфийской хромосомы (Phl-хромосома). Наличие Phl-хромосомы можно рассматривать как диагностический маркер хронического миелолейкоза, поскольку в развернутой клинической стадии этой формы гемобластоза она встречается у 98-100% клеток костного мозга.

Мутация протоонкогенов. Мутация протоонкогенов может возникать под действием химических, физических и биологических факторов. Поскольку сам протоонкоген исключительно мал, мутации может подвергаться крайне ограниченный его участок (один нуклеотид из тысячи). Тем не менее, если мутация состоялась, то она неизбежно ведет к качественным изменениям регулирующей функции онкогена и далее синтезу и накоплению под влиянием активированного онкогена онкобелка. Подтверждением роли мутаций в активации протоонкогенов могут служить эксперименты с микроинъекцией всего лишь единичной копии мутированного клеточного онкогена (например, копии активного c-Ha-ras), которой оказалось достаточной для формирования опухолевой трансформации клетки).

Инсерция и транспозиция. Экспериментальная активация клеточного протоонкогена возможна путем внесения в клеточный геном чужеродного (вирусного) генетического материала (см. выше, раздел «Включение промотора»). Активация возможна только в том случае, если «навязываемый» нуклеотиду материал встраивается в определенную позицию на ДНК вблизи протоонкогена. Только в этом случае активная вирусная «промоторная ДНК» превращает «молчащий» ген в действующий.

Трансдукция (См. выше).

В геноме человека имеется примерно 35000-45000 генов. Общее количество протоонкогенов и онкогенов среди них едва ли превышает 100. К 1994 году обнаружено 67 с-онкогенов (данные таблицы 3-6). Один и тот же c-онкоген может «работать» в разных опухолях и у разных видов животных. Так, клеточный онкоген N-ras активен в культурах клеток рака легкого, толстой кишки, фибросаркомы, рака печени, нейробластомы и промиелоцитарного лейкоза. С другой стороны, в клетках одной и той же опухоли могут проявлять активность несколько разных с-онкогенов. Например, в клетках саркомы Юнга обнаружены активные с-онкогены myb (миелобластоз), mye (миелоцитоз), fes (саркомы кошек). Это свидетельствует о том, что каждый, а не какой-то определенный с-онкоген может вызвать опухолевую трансформацию в любой нормальной клетке. Кроме того, для обеспечения опухолевой трансформации необходимо действие не одного единственного онкогена, а, по крайней мере, двух или, возможно, большего числа онкогенов.

В настоящее время уже ни у кого не вызывает сомнений, что клеточные протоонкогены представляют собой набор генов, регулирующих рост и дифференцировку клеток. C-онкогены кодируют синтез факторов роста, которые стимулируют пролиферацию. Наоборот, гены, вызывающие супрессию опухолевого роста, кодируют синтез белков, которые нейтрализуют действие ростовых сигналов. Мутации или активация онкогенов, кодирующих синтез ростовых факторов, и инактивация генов супрессии опухоли, приводят к опухолевой трансформации, которая выражается в экспрессии с-онкогенов и генов супрессии опухоли. Так, установлено, что онкогены, вовлекаемые в карциному молочной железы, кодируют выработку многих онкобелков со свойствами факторов роста: int-2, bst, bcl-1 (факторы роста), erb-2, erb-A, erb-B3 (рецепторы факторов роста), ras (преобразователи сигналов), myc, mys, fos (ядерные регуляторы), а гены-супрессоры опухолевого роста, кодирующие выработку соответствующих белков-супрессоров - rb-1 и p53.

В целом онкобелки, или раковые белки, синтезируются под влиянием активных с-онкогенов клетками, трансформированными в опухолевые. С помощью онкогенов измененная (опухолевая) генетическая программа реализуется в биологические признаки опухоли, или атипизмы. Выше указывалось, что образование онкобелков в следовых количествах в нормальных клетках кодируется протоонкогенами. Пока неизвестно, какую физиологическую роль играют протоонкогены и кодируемые ими белки в нормальных клетках. Считают, что они берут на себя функцию факторов роста, колониенстимулирующих факторов или подобные им функции.

Наряду со сложными взаимодействиями с-онкогенов и генов-супрессоров опухолевого роста практически при любом бластомном процессе обнаруживаются другие генетические аномалии. Среди них называют делеции (потеря участка хромосомы или хроматиды), транслокации, инверсии генов, моносомии, трисомии специфических хромосом. Так как такие аномалии хромосом встречаются при определенном типе опухолей, предполагается, что они вовлекаются в канцерогенеза. Например, колоректальная карцинома сопровождается экспрессией активных с-онкогенов (ras, mys, src), инактивацией или делециями генов-супрессоров опухолевого роста, а также делециями хромосом 1 и 22. Перечень некоторых хромосомных хромосомных аномалий представлен в табл. 3-7.

Таблица 3-6