Методическое пособие биохимия человека

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования ТЮМЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ Институт математики, естественных наук и информационных технологий

кафедра анатомии и физиологии человека и животных

В.Н. Дубровский, О.В. Фролова, Д.Н. Кыров, Е.А. Силиванова

БИОХИМИЯ ЧЕЛОВЕКА Учебно-методическое пособие

для студентов направления 020400.62 Биология, форма обучения – очная и направления 034300.62 Физическая культура, форма обучения – очная и заочная

Тюмень

Издательство Тюменского государственного университета

2011

1

УДК 612.015+577.1(075.8) ББК 28.902 Аз: Б638

Биохимия человека: Дубровский В.Н, Фролова О.В., Кыров, Д.Н., Силиванова Е.А. Учебно-методическое пособие для студентов направления 020400.62 Биология, форма обучения – очная и направления 034300.62 Физическая культура, форма обучения – очная и заочная. Тюмень: Издательство Тюменского государственного университета, 2011, 84 стр.

Учебно-методическое пособие предназначено для проведения занятий по курсу «Биохимия человека». Издание содержит необходимые понятия и теоретические материалы, рекомендации по проведению лабораторных занятий, вопросы семинарских занятий и рекомендованную литературу.

Рабочая программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ: Биохимия человека [электронный ресурс] / Режим доступа: http://www.umk3.utmn.ru., свободный.

Рекомендовано к изданию кафедрой анатомии и физиологии человека и животных. Утверждено проректором по учебной работе Тюменского государственного университета.

ОТВЕТСТВЕННЫЙ РЕДАКТОР: В.С. Соловьев – д.м.н., профессор

РЕЦЕНЗЕНТЫ: О.Н. Лепунова, к.б.н., доцент; И.В. Пак, д.б.н., доцент.

©ГОУ ВПО Тюменский государственный университет, 2011.

©В.Н Дубровский, О.В. Фролова, Д.Н. Кыров, Е.А. Силиванова, 2011

2

1. Пояснительная записка.

Учебно-методическое пособие разработано в соответствии с программой преподавания курса «Биохимия человека» для студентов для студентов направления 020400.62 Биология и 034300.62 Физическая культура. Лабораторный курс направлен на:

-изучение студентами под руководством преподавателя основ биохимии человека;

-формирование у студентов практических навыков по использованию лабораторного оборудования для изучения химического строения, физико-химических свойств и функций изучаемых веществ;

-освоение студентами навыков описания практического выполнения и результатов лабораторных работ.

3

ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В УЧЕБНОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Общие правила работы в лаборатории.

1.До начала занятия необходимо внимательно ознакомиться

стемой работы, используя методические пособия, учебник и конспект лекций.

2.В биохимической лаборатории следует работать в халате. В лаборатории запрещается снимать и развешивать верхнюю одежду, громко разговаривать, принимать пищу, курить, включать и выключать рубильники и трогать приборы, не относящиеся к данной работе.

3.Рабочее место следует содержать в чистоте, не загромождая его предметами, не относящимися к данной работе. Реактивы, пролитые или рассыпанные на столе или на полу, следует тотчас же убрать и нейтрализовать.

4.Лишние книги, журналы и тетради не должны находиться на рабочем столе. Методические пособия, необходимые для работы, рабочие тетради и журнал следует оберегать от попадания на них воды, кислот, щелочей и других химических реактивов.

5.Реактивы, предназначенные для общего пользования, нельзя уносить на свое рабочее место. Чтобы не спутать пипетки, служащие для взятия реактивов, и пробки от склянок, после взятия требуемого количества реактива их следует немедленно возвращать на место. Прежде чем отойти от стеллажа с реактивами, убедитесь в том, что реактив закрыт и поставлен на своё место. Сухие реактивы берут чистым микрошпателем или специальной ложечкой.

6.Если реактив взят в избытке и полностью не израсходован, категорически воспрещается выливать его обратно в склянку с исходным реактивом.

7.По окончании работы необходимо тщательно убрать рабочее место, выключить электронагревательные приборы, закрыть воду и газ.

8.Категорически воспрещается проводить опыты, не относящиеся к данной работе, без ведома преподавателя.

Техника безопасности и меры предосторожности.

1.Все опыты, связанные с применением или образованием ядовитых веществ, а также вредных паров и газов, разрешается проводить только в вытяжном шкафу, дверцы которого должны быть опущены на 1/3. В случае прекращения работы вентиляционных установок опыты в вытяжных шкафах должны быть немедленно прекращены.

2.Запрещается проводить опыты со всевозможными взрывчатыми и огнеопасными смесями. Опыты с малыми

4

количествами (1-2 мл) легко воспламеняющихся веществ (например, со спиртовыми растворами) проводят только вдали от огня.

3.При нагревании и кипячении растворов в пробирке необходимо пользоваться держателями и следить за тем, чтобы отверстие пробирки не было обращено в сторону самого работающего или соседа по рабочему столу. Это особенно важно соблюдать при нагревании концентрированных растворов кислот и щелочей.

4.Не следует наклоняться над сосудом, в котором происходит нагревание или кипячение жидкости, во избежание попадания брызг в лицо и глаза. При необходимости определить запах паров или выделяющегося газа не вдыхать их непосредственно из рабочего сосуда, а легким движением руки направить газы к себе и осторожно вдохнуть.

5.При разбавлении концентрированных кислот (особенно серной) и щелочей следует небольшими порциями вливать кислоту (или щелочь) в воду, а не наоборот, непрерывно перемешивая раствор.

6.Если склянка с легко воспламеняющейся жидкостью опрокинется или разобьётся, следует тотчас же выключить все находящиеся вблизи грелки, засыпать разлитую жидкость песком, собрать его и перенести в предназначенный для этого железный ящик.

Оказание первой помощи.

1.При воспламенении горючей жидкости на одежде работающего необходимо погасить пламя на пострадавшем, завернув его в асбестовое или шерстяное одеяло, которое должно находиться в аудитории на постоянном, заранее известном месте.

2.При ожогах концентрированными растворами кислот обожженное место промывают сильной струей воды в течение 2-3 минут, затем 2-3% раствором соды, после чего накладывают марлевую повязку, смоченную 1-2% раствором перманганата калия. При сильных ожогах следует после оказания первой помощи обратиться к врачу.

3.При ожогах концентрированными растворами щелочей обожженное место промывают обильным количеством воды до тех пор, пока кожа не перестанет казаться скользкой, затем 1-2% раствором борной кислоты или уксусной кислоты, после чего накладывают марлевую повязку, смоченную спиртовым раствором танина или 1-2% раствором перманганата калия.

4.При ожогах горячими металлами или стеклом обожженное место многократно смачивают раствором перманганата калия и спиртом, а затем смазывают мазью от ожогов.

5.При попадании кислоты, щелочи или какого-либо другого реактива в глаза следует их промыть обильным количеством воды и немедленно направить пострадавшего к врачу.

5

6.при отравлении сероводородом, хлором, парами брома, окисью углерода пострадавшего надо вывести на свежий воздух, а затем направить к врачу.

7.При отравлении цианистым соединениями, а также солями мышьяка и ртути необходимо немедленно обратиться к врачу.

Указания к выполнению лабораторных занятий по биохимии.

1.Приступая к выполнению лабораторной работы, студент должен осмыслить её значение в овладении теоретическим материалом курса биохимии. Внимательно прочитать методическую разработку лабораторной работы и уяснить, что нужно выполнить на пратике и как правильно оформить работу.

2.Соблюдать требования гигиены при выполнении работы.

3.При работе с аппаратурой, реактивами, химической посудой необходимо ознакомиться с правилами эксплуатации и техникой безопасности и лишь затем приступать к работе с ними.

6

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

ЦВЕТНЫЕ РЕАКЦИИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ.

Теоретическая часть.

В группу аминокислот объединены различные по химической структуре соединения, которые роднит между собой наличие в их составе одной или нескольких карбоксильных и аминогрупп, а также, в некоторой степени, их присутствие в первичной структуре белковых молекул. Помимо карбоксильной и аминогруппы каждая молекула аминокислоты содержит в своем составе сугубо индивидуальную химическую группировку, называемую боковым радикалом, которая в значительной мере определяет их химические свойства и, конечном итоге, химические свойства пептидов и белков, в состав которых они входят. Изучение химических свойств и белков, и аминокислот является важным, во многом в связи с попытками осуществления направленного синтеза пептидов и белков in vitro без участия белоксинтезирующего аппарата клетки. Большое значение знание химических свойств аминокислот имеет в определении аминокислотной последовательности белков, а также в экспериментах связанных с заменой определенных аминокислот в первичной последовательности белка путем химической модификации их бокового радикала. Наиболее удобными для селективной модификации являются боковые радикалы аминокислот лизина, аргинина, цистеина, цистина, метионина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, тирозина триптофана. Участие ряда аминокислот в химических реакциях сопровождается изменением цвета раствора, что позволяет легко визуальным путем определить наличие той или иной аминокислоты в растворе. В случаях, когда количество образующегося окрашенного продукта пропорционально количеству содержащейся в растворе определенной аминокислоты, возможно не только качественное, но количественное определение аминокислот.

Существует два типа цветных реакций: 1) универсальные — биуретовая (на все белки) и нингидриновая (на все α-аминокислоты и белки); 2) специфические — только на определенные аминокислоты как в молекуле белка, так и в растворах отдельных аминокислот (реакция Фоля на аминокислоты, содержащие слабосвязанную серу, реакция Миллона на тирозин, реакция Сакагучи на аргинин и т.д.).

При проведении цветных реакций на белки и аминокислоты необходимо предварительно составить следующую таблицу:

№	Название	Применяемые	Появление	Что открывает данная
	реакции	реактивы	окрашивания	реакция, её химизм

7

H

R2

O

H

R4 O

+ 2NaOH

+ CuSO4

H2

N––CH––C––N––CH––C––N––CH––C––N––CH––C––N––CH–…

R1

O

H

R3

O

H R5

полипептид

R2

OН

R4

OН

H2N––CH––C

––N––CH––C––N––CH––C

––N––CH––C––N––CH–…

R1

OН

R3

OН

R5

енольная форма полипептида

R2

C––N––CH––C––N––CH––R3

R1––CH

O

O

C––O––Na

NH2

Cu

N

HR4––CH

––C –––N –– C––O––Na R5

биуретовый медный комплекс сине-фиолетового цвета

Практическая часть.

1. Биуретовая реакция Принцип метода. Биуретовая реакция открывает пептидную

связь в белке. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине–фиолетовый цвет, а продукты неполного гидролиза его — пептоны — розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция схематично протекает так:

Енольная форма полипептида, образованная в сильно щелочной среде, дает отрицательный заряд, и кислород, взаимодействуя с медью, образует ковалентную связь, а, взаимодействуя с атомами азота, медь образует координационные связи. Степень окраски биуретового комплекса зависит от концентрации белка и количества медной соли в растворе. Нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует характерное фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

Отдельные аминокислоты, такие как гистидин, серин, трионин, аспарагин дают положительную биуретовую реакцию при условии больших концентраций их в растворе.

8

COONa						COONa
		CH – NH4						CH – NH4
		CH2
					N	CH2
			N					Медный комплекс с
								гистидином в случае
		N		Cu				биуретовой реакции
						N

Примечание: биуретовая реакция получила свое название от производного

мочевины — биурета. Биурет, имеющий группировку –CO-NH- образуется при нагревании мочевины с отщеплением от неё аммиака и дает то же окрашивание,

что и белки.

Образование биурета:					Строение биуретового комплекса:
		NH2			–O––C––NH			HN––C––O–
NH2	NH2	C––O
					HN		Cu
										NH
C––O	+ C––O	NH		+ NH3		O		O
NH2	NH2	C––O
					C–––NH			HN–––C
		NH2

Как можно видеть из приведенной выше формулы, биурет в щелочной среде

претерпевает полную енолизацию по схеме:

H2N––C––NH––C––NH2 HN––C––NH––C––NH

O

O

OH

OH

Реактивы: раствор яичного белка (1—2 белка куриных яиц отделяют от желтков, взбалтывают с 1 л воды); едкий натр 10% раствор; сернокислая медь 1% раствор.

Ход работы: к 5 каплям раствора белка прибавляют 3 капли 10% раствора едкого натра и 1 каплю сернокислой меди, перемешивают; содержимое пробирки приобретает фиолетовый цвет.

2. Нингидриновая реакция.

Принцип метода. Нингидриновая реакция характерна для аминокислот, чья аминогруппа находится в α-положении, а также белков и полипептидов. Аминокислоты, полипептиды, белки при кипячении с водным раствором нингидрина дают синее или синефиолетовое окрашивание. В результате взаимодействия α- аминокислоты с нингидрином образуется шиффово основание, которое перегруппировывается, декарбоксилируется и расщепляется на альдегид и аминодикетогидринден. Химизм реакции с водным раствором нингидрина следующий:

9

Аминодикетогидринден конденсируется ещё с одной молекулой нингидрина. Образовавшееся соединение, енолизируясь, переходит в окрашенную форму, получившую название «сине-фиолетовый комплекс Руэмана», формула которого

O		O
C Н		C
C––NН2	+ О––С	–H2O
C		C
O		O
аминодикетогидринден		нингидрин
OH	O
C	C
C–– N––С
C	C
O	O

сине-фиолетовый комплекс Руэмана

O

C

C––O + H2N––CH––COOH

				–H2O
	C
				R

O

нингидрин

O
C					Н
										– СО2
				C––N		––		C––COOH		декарбокси-
C						R
									лирование
O

O

C Н

C––NН2 + О––С––Н

C R

O альдегид аминодикетогидринден

O		O
C	Н	C
C–– N––С
C		C
O		O
O–	O
C	C
C–– N––С		+ H+
C	C
O	O

O

C

перегруппировка

C––N––CH––COOH

C R

O

шиффово основание

	O
	C					Н
										+Н2О
					C––N––CН
										расщепление
	C
							R
	O

Реактивы: раствор яичного белка, нингидрин, 0,1 % раствор.

10