Лекции / MBD_i_streptokokki

Примеры сложных серологических реакций

Молекулярно-генетические методы исследования

Позволяют обнаружить в образцах нуклеиновые кислоты возбудителя (НК).

Они высокоспецифичны, что обусловлено индивидуальностью геномов организмов и применении принципа комплементарности, т.е. соответствия друг другу нуклеотидных пар (А-Т; Г- Ц)

Включают ПЦР (полимеразную цепную реакцию), секвенирование ДНК, молекулярная гибридизация

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

Цели

обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без

выделения чистой культуры

идентификация микроорганизмов

генотипирование микроорганизмов

ПЦР

Сутьциклическое удвоение (амплификация) определенного участка ДНК с помощью праймеров.

Увеличение количества копий идет в геометрической прогрессии.

Ингредиенты реакции:

Исследуемая ДНК;

2 праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей двунитчатой ДНК;

Нуклеотиды 4 видов;

Термостабильная полимераза (от Thermus aquaticus)

Буферная смесь

Этапы ПЦР

«Плавление» – смесь за 1 мин прогревают при 94 С, комплементарные ДНК разъединяются

«Отжиг» - t снижают до 45-65 С и выдерживают ее 1-1,5 мин. К одноцепочечной ДНК присоединяется праймеры

«Элонгация» - t 72 С, она оптимальна для работы фермента, который используя нуклеотиды из смеси достраивает комплементарные нити, начиная с 3-концов

Рабочее место при проведении ПЦР и

термоциклер (амплификатор)

Детекция амплифицированной ДНК

В агарозном геле с помощью электрофореза;

По флюорисценции в автоматическом режиме;

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Цель

Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации

микроорганизмов – сравнение ДНК

выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)

МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ

ГИБРИДИЗАЦИИ

Принцип осуществления

исследуемая ДНК



нагрев в щелочной среде



расплетение на две отдельные нити



закрепление одной из них на специальном фильтре



помещение этого фильтра в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную

радиоактивным изотопом)



понижение температуры



+- восстановление двойной спирали

–- двойная спираль не восстанавливается

Секвенирование ДНК

Позволяет определить последовательность

нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК