17. Рск: этапы, методика определения рабочей дозы комплемента, подготовка гемолитической системы.

Реакция заключается в том, что при наличии специфичности антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент, то есть происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. РСК проводят в две фазы: 1-инкубация смеси, содержащей 3 компонента:антиген, антитело и комплемент; 2-выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним.

18. Особенности современных серологических реакций с использованием меток.

1)Для проведения этих реакций используют метку, которую соединяют с АГ или АТ; 2)эти серологические реакции происходят быстрее и качественнее; 3)они являются высокочувствительными и возможна точная регистрация результатов специальными приборами; 4)их проводят на стекле или в полистироловых планшетах с лунками. Требования к меткам: а)не изменять специфичность АТ или АГ; б)быстро и легко выявляться; в)определяются количественно.

19. Механизм, цели применения реакции иммунофлюоресценции (риф), виды риф, основные ингредиенты.

Реакция является методом экспресс-диагностики для выявления антигенов микробов или определения антител. Различают: 1)прямой метод РИФ-основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные специфичными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа; 2)непрямой метод РИФ-заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом.

20. Механизм, цели применения иммуноферментного анализа (ифа), ингредиенты.

1)Используется для выявления микробных антигенов или противомикробных антител с пом.антител, конъюгированных с ферментной меткой (пероксидазой хрена/щелочной фосфатазой). После соединения иммунного комплекса с меченой ферментом имм.сывороткой добавляют субстратно-хромогенрую смесь. Субстрат расщепл-ся ферментом и изменяется цвет продукта реакции. При этом интенсивность окраски прямо пропорц. кол-ву связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней (ВИЧ-инфекций, гепатита В и др), для опред.гормонов, ферментов, лек.препаратов и других БАВ, содерж-ся в исслед.материале в низких концентр. – 10^-10-10^-12г/л

2)Тфедофазный ИФА – наиболее распростр.вариант ИФА, когда один из компонентов имм.реакции(антигены или антитела) сорбирован на тв.носителе, н-р в лунках микропланшетов из полистерола. При опред-ии антител в лунки послед.добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку,меченную ферментом, субстрат для фермента (Н₂О₂ / фосфатид) и хромоген (индикатор,окрашивающий продукт ферментации). Каждый раз после доб-ия компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путём тщательного промывания. При «+»результате изменяется цвет р-ра хромогена. Твёрдофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген + имм.сыворотку против антигена,меч.ферментом + субстрат для фермента и хромоген.

21. Механизм, ингредиенты радиоиммунного анализа (РИА) – высокочувств.метод, основанный на реакции антиген-антитело с применением антигенов или антител, меченных радиоизотопами (¹²⁵J, ¹⁴C, ³H, ⁵¹Cr и др). После их взаимодействия отделяют обр-ся рдиоактивный имм.комплекс и опред. его радиоактивность в соответст.счетчике (бета- или гамма-излучение): интенсивность излучения прямо пропорц.кол-ву связавшихся молекул антигена и антител. При твёрдофазном варианте РИА один из компонентов ре-ции (антиген или антитела) сорбирован на тв.носителе, н-р в лунках микропанелей из полистирола. При др.варианте метода – конкурентном РИА – искомый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного кол-ва антител иммунной сыворотки. Этот вариант используют для опред.кол-ва антигена в исслед.материале. Риа применяют для выявл.антигенов микробов, опред.гормонов,ферментов, лек.вещ-в и иммуноглобулинов, а также иных вещ-в, содерж-ся в исслед.материале в низких концетр. – 10^-10 – 10^-12 г/л.

22.Механизм, ингредиенты иммуноблоттинга (ИБ) - высокочувств. метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Смесь антигенов микроо-ма (родовых, видовых, групповых) разделяют на фракции, содержащие отдельные антигены с пом. электрофореза полиакриламидном геле. Затем переносят его из геля на нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блоттами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязав-ся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меч.ферментом. Образовавшиеся на полоске комплексы антиген+антитело больного+антитело против Ig человека,меч.ферментом. ИБ используют как диагн.метод при ВИЧ-инфекции, сифилисе, листериозе и др.

23. Механизм , ингредиенты иммунной электронной микроскопии (ИЭМ) – электронная микроскопия микробов, чаще вирусов, обработанных соответств.антителами. Порядок действия: 1)метериал, в котором предполагается наличие искомого вируса, смешивается и инкубируется со стандартной имм.сывороткой.

2)комплекс вирус-антитело осаждается центрифугированием в подходящих для него режимах.

3) к ресуспендированному осадку добавл.контрастирующее в-во, и полученный препарат исследуется под эл.микроскопом. в качестве метки – белок ферритин.

В «+» результате выявляют характерные агрегаты,сост.из вирусных частиц, соединенных между собой мостиками из антител. Порог ИЭМ невысок: 10⁴ – 10⁶ частиц в мл. Преимущество: возможность оценивать исход серологической реакции, идентифицирование её морфологического субстрата, т.е можно опред.форму и размер вирусных частиц.

24. Иммунный статус человека. Понятие, уровни, тесты оценки. ИС-это количественные и функциональные характеристики факторов иммунитета организма, определенные в конкретный момент времени. Ф-ции иммунной системы снижают различн.факторы – несбалансированное питание, инфекции, ионизирующее излучение, хим.в-ва. Подобные нарушения – иммунодефициты – разделяют на первичные(врождённые) и вторичные (приобретённые). Врожденные дефекты иммунной системы встреч.сравнительно редко и обусловлены генными дефектами. Вторичные нарушения часто предствл.звенья патогенеза многих патологических состояний (н-р болезней злокачественного роста,эндокринных расстройств). Особенно часто вторичные расстройства развиваются при бактериальных и вирусных инф-ях, обычно нося временный характер. Дефекты могут затрагивать различные компоненты иммунной системы. Выделяют Т-клеточные, В-клеточные, и комбинированные (Т-В-клеточные) иммунодефициты. Также возможны расстройства гуморальных и клеточных факторов неспециф.защиты оранизма. Для выявления иммуннодефицитных состояний возникает необходимость оценки показателей функциональной активности иммунной системы, т.е иммунного статуса. Для изучения иммунного статуса используют принцип двухэтапной оценки иммунологического статуса.

25. Тесты оценки иммунного статуса человека I уровня и методы их определения. На первом этапе выделяют грубые дефекты в системе гуморального и клеточного иммунитета. Этим требованиям отвечают иммунологические тесты 1 уровня, включающие в себя: определение общего и относительного числа лимфоцитов; основных субпопуляций (Т- и В-клетки); фагоцитарной активности лейкоцитов; концентр. Иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови.

Общее и относительное число лейкоцитов определяют по данным клинического анализа крови. Для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови определяют процент фагоцитирующих клеток и фагоцитарный показатель (ср.кол-во микробных клеток,поглощенных одним лейкоцитом). Концентрацию (уровень) иммуноглобулинов разных классов G,M,A,E в сыворотке крови определяют в реакции преципитации в геле (радиальная иммунодиффузия по Манчини)с антиглобулиновыми сыворотками к Ig G, Ig M, Ig A, Ig E, но этот метод дает достаточно большую ошибку 15%.

26. Тесты оценки иммунного статуса человека II уровня и методы их определения. При наличии отклонений в ориентирующих тестах более тщательный анализ иммунологического статуса рекомендуется проводить с пом. аналитических тестов II уровня. Используют: 1)иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью проточной цитофлюоримерии(определяет детальные характеристики клеточных субпопуляций и производить препаративное разделение), 2) иммунофлюоресценции (численность субпопуляций), 3) использование моноклональных антител (МАТ) для определения специфич.клеточных рецепторов.

МАТ-это особый вид иммунных сывороток,отлич.высокой специфичностью.

Иммунный статус у каждого индивидуален. Чтобы определить отклонения, нужно сравнивать с показателями у данного человека на фоне полного здоровья.

27.Реакция Манчини: цель, механизм и ингредиенты реакции. Реакция радиальной иммунодиффузии (р-ия Манчини). Иммунную антиглобулиновую сыворотку смешивают с расплавленным агаровым гелем и равномерно наливают на стекло. После застывания в геле делают лунки, в которые помещают антиген(Аг) в различных разведениях. В качестве АГ используют сыворотки человека с известной концентрацией IgG и исследуемые сыворотки с неизвестной концентр IgG. Антиген диффундируя в гель, образует с антителами антиглобулиновой сыворотки кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца пропорционален концентр Аг. Реакцию используют для определения в сыворотки крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

28. Механизм, ингредиенты, постановка реакции определения титра комплемента. Комплемент – это совокупность неск.нормальных компонентов свежей сыворотки с различными физико-химическими св-вами. Он содержится в большинстве сывороток теплокровных и холоднокровных животных. Основным св-вом комплемента явл.его способность вызывать лизис сенсибилизированных соответствующими имм.сыворотками клеток, а также адсорбироваться системами антиген+антитело. Комплемент широко применяется для серологической диагностики ряда инфекционный заболеваний в ре-ции связывания комплемента (сифилис, гонорея,бруцеллез,туляремия,грипп,клещ.энцефалит). Чтобы выбрать оптимальную дозу комплемента используют титрование. Титр комплемента – min его концентр, обеспеч-щая полный лизис 3% взвеси бараньих эритроцитов в присутств.гемолитической сыворотки. Рабочая доза комплемента увеличивается по сравнению с титром на 25-30%. Избыток или недостаток комплемента могут значительно исказить результаты.