Микробиология

91

Методы получения накопительных культур из природных источников основных физиологических групп микроорганизмов (главным образом бактерий)

Для выделения определенных микроорганизмов из природных источников можно использовать почти бесконечное множество комбинаций различных внешних факторов как химических, так и физических. Техника накопительных культур - один из наиболее мощных методов, имеющихся в распоряжении микробиолога. Методы обогащения позволяют при желании выделять те или иные виды микробов, используя их специфические потребности. Эти методы можно безгранично варьировать с целью выделения и изучения не описанных ранее организмов, способных расти в условиях, созданных исследователем.

Синтетические накопительные среды для хемогетеротрофов

Условия и питательные вещества, необходимые для накопления в синтетической среде различных хемогетеротрофов, указаны в схеме на рис.1, а подробно состав каждого из таких сред приведен в табл.1.

Для накопления организмов, осуществляющих брожение, важна химическая природа органического субстрата. Чтобы субстрат мог сбраживаться, он не должен быть ни слишком окислен, ни слишком восстановлен. Прекрасными субстратами для брожения служат сахара, но сбраживаться могут и многие другие органические соединения примерно того же уровня окисленности. Инкубацию накопительных культур следует проводить в анаэробных условиях не только потому, что некоторые организмы, получая энергию в результате брожения, являются облигатными анаэробными, но и для того, чтобы предотвратить конкуренцию со стороны аэробных форм. В качестве источника азота нельзя использовать нитрат, т.к. в этом случае смогут расти и денитрифицирующие бактерии. Если накапливаемые организмы образуют кислоту, а сами к ней чувствительны, то можно добавить в среду углекислый кальций.

В синтетических средах при анаэробных условиях можно также проводить накопление трех особых групп хемогетеротрофных бактерий, для которых тер-

минальными окислителями в дыхательном метаболизме вместо О служат другие

2

неорганические соединения. В этих случаях не следует использовать такие легко сбраживаемые субстраты, как сахара.

92

Рис. 1 - Основные факторы, существенные для получения накопительных культур хемогетеротрофных бактерий в синтетических средах

(по Р.Стейниер и др., 1979)

Таблица 1 - Условия для получения накопительных культур хемогетеротрофных бактерий1)

Добавки к основной среде2)			Особые условия среды		Накапливаемые
органические		неорганические	атмосфера	рН	организмы
Этиловый	спир,	Нет	Воздух	7,0	Azotobacter
4,0
Этиловый	спир,	NН4С1,	Воздух	7,0	Аэробы	(например
4,0		1,0			Pseudomonas)
Этиловый	спир,	NaNO3,	Нет (сосуд	7,0	Денитрифицирую-
4,0		3,0	закрыт)		щие бактерии		(на-
					пример,	некоторые
					виды Pseudomonas)
Этиловый	спир,	NH4C1, 1,0	Нет (сосуд	7,2	Desulfovibrio
4,0		Na2SO4, 5,0	закрыт)
Этиловый	спир,	NH4C1, 1,0	Нет (сосуд	7,4	Метанообразующие
4,0		NaHCO3, 1,0	закрыт)		бактерии
		CaCO3, 5,0
Глюкоза, 10,0		CaCО3, 5,0	Чистый N2	7,0	Clostridium pastori-
					anum и родственные
					виды
Глюкоза, 10,0		NH4C1, 1,0	Нет (сосуд	7,0	Энтеробактерии		на-
			закрыт)		пример,	Escherichia,
					Enterobacter)
1) Инкубация при 25-30°С, в темноте			. Основная среда (содержание компонентов
в г/л): MgSO4×7H2O, 0,2; K2HPO4, 1,0; FeSO4×7H2O, 0,05; CaCl2, 0,02; MnCl2×4H2O,
0,002; NaMoO4×2H2O, 0,001.
2) Количества их указаны в граммах на 1 л

93

Для денитрифицирующих бактерий в качестве терминального окислителя в среду добавляют нитрат, а в качестве источника углерода и энергии - уксусную кислоту, масляную кислоту или этиловый спирт. Для сульфатредуцирующих бактерий добавляют относительно высокие концентрации сульфата, т.к. для них это специфический терминальный окислитель. Лучшим источником углерода и энергии служат молочная или яблочная кислота, но не уксусная. Для карбонатвосстанавливающих (метанообразующих) бактерий в качестве окислителя необходим СО2 (одновременно служит и источником углерода), а источником энергии и углерода может служить муравьиная кислота. Следует отметить, что для накопления бактерий, восстанавливающих сульфаты и карбонаты, желательно использовать в качестве источника азота аммиак, т.к. добавление нитрата будет благоприятствовать развитию микроорганизмов, восстанавливающих нитраты. Для накопления бактерий, восстанавливающих карбонаты и нитраты, следует понизить до минимума концентрацию в среде сульфата, чтобы предотвратить усиленный рост сульфатредуцирующих бактерий.

Очевидно, что для накопления микроорганизмов, получающих энергию за счет аэробного дыхания, необходимы аэробные условия. Органическими питательными веществами могут быть как сбраживаемые, так и несбраживаемые субстраты. Однако, если используется сбраживаемый субстрат, то нужна обильная и постоянная аэрация культуры, т.к. истощение запасов кислорода в среде в -ре зультате дыхания благоприятствует накоплению анаэробов. Легко сбраживаемые соединения обычно стимулируют рост факультативных анаэробов. Поэтому при включении в накопительную среду глюкозы или какого-нибудь другого сахара как в аэробных, так и в анаэробных условиях вырастают главным образом виды

Enterobacter.

Использование несбраживаемых субстратов приводит обыкновенно к накоплению облигатных аэробов, чаще всего представителей родаPseudomonas. Например, включая в качестве единственного органического вещества бенвоат натрия (1 г/л), можно получить окисляющие бензоат штаммы Pseudomonas putida. Если же единственным источником как углерода, так и азота будет аспарагин(2 г/л), то в культуре будут преобладать окисляющие аспарагин штаммы этого или родственного ему видов.

В синтетических средах для накопления аэробов в качестве источника азота обычна используют соли аммиака. Если не добавлять соединения азота, то можно выделить культуры азотфиксирующих аэробных бактерий родаAzotobacter. Виды Azotobacter могут использовать в качестве единственного органического вещества огромное множество различных субстратов, включая спирт, масляную и бензойную кислоты, глюкозу.

Методы получения накопительных культур хемоавтотрофных и фотосинтезирующих микроорганизмов

Для накопления хемоавтотрофных и фотоавтотрофных организмов из среды следует исключить органические соединения, а в качестве единственного источника углерода использовать СО2 и бикарбонат (табл. 2 и 3, рис. 2 и 3).

94

Таблица 2 - Условия для накопительных культур некоторых хемоавтотрофных бактерий1)

Рис.2 - Основные внешние факторы, определяющие получение накопительных культур некоторых автотрофных бактерий (по Р.Стейниер и др., 1979)

95

Рис.3 - Основные факторы, определяющие получение накопительных культур фотосинтезирующих микроорганизмов (по Р.Стейниер и др., 1979)

Фотосинтезирующие формы нуждаются в свете, а культуры хемоавтотрофов нужно выращивать в темноте, чтобы предотвратить развитие фотосинтезирующих микроорганизмов. Во время инкубации культур необходимо поддерживать либо анаэробные, либо аэробные условия в зависимости от того, нуждаются ли данные организмы в кислороде. Исключение 'из этого правила составляют водоросли: т.к. они в процессе метаболизма сами выделяют кислород, то фактиче-

96

ски все равно, будем ли мы инкубировать накопительные культуры водорослей в аэробных и анаэробных условиях.

Среды, предназначенные для получения накопительных культур и выращивания фотосинтезирующих организмов, должны содержать натрий, т.к. известна, что этот элемент необходим для фотосинтезирующих бактерий.

Среда накопления пурпурных бактерий должна содержать подходящий органический субстрат, а иногда и бикарбонат. Этот субстрат не должен легко сбраживаться. Обычно используют уксусную, масляную или яблочную кислоту. Если углерод в субстрате(как, например, в масляной кислоте) восстановлен в большей степени, чем в материале клетки, то нужно добавлять в среду бикарбонат, т.к. фотосинтез сопровождается потреблением CО2. При использовании та-

ких субстратов, как яблочная кислота, при метаболизме которой образуется СО ,

2

добавление бикарбоната не обязательно. Так как фотогетеротрофные бактерии нуждаются в. различных факторах роста, то обычно в среду для их накопления добавляют небольшое количество дрожжевого экстракта.

Использование сложных накопительных сред

В табл.4 приведены примеры сложных сред, используемых для накопления отдельных видов хемогетеротрофов.

97

Накопительные культуры некоторых бактерий, обладающих крайне сложными потребностями в питательных веществах, получить весьма трудно. Тем не менее такие организмы можно выделить ив природного источника, используя специально разработанные сложные среды. Примером могут быть молочнокислые бактерии. Для них характерна высокая устойчивость к молочной кислоте, которую они сами образуют при сбраживании сахара. Для накопления молочнокислых бактерий используют слабозабуференную среду, содержащую глюкозу и ка- кой-нибудь богатый источник факторов роста(например, 20 г глюкозы и10 г дрожжевого экстракта на1 л среды). После инокуляции, которую желательно производить природным материалом, содержащих много молочнокислых бактерий (например, кусочками овощей, сырым молоком, сточными водами), проводят инкубацию при анаэробных условиях. Обычно сначала развиваются такие бактерии, как Enterobacter и Escherichia. Однако постепенно в среде накапливается молочая кислота, и условия становятся все менее и менее благоприятными для этих бактерий, тогда как молочнокислые бактерии продолжают расти. В конце концов среда закисляется настолько, что начинают преобладать молочнокислые бактерии, а большинство других организмов погибает.

Примером сложной селективной среды служит среда для накопления пропионовокислых бактерий. Эти бактерии образуют при брожении пропионовую кислоту, уксусную кислоту и СО2. Хотя они легко сбраживают глюкозу, все равно не могут конкурировать в содержащей глюкозу среде ни Enterobacter,с ни с молочнокислыми бактериями, т.к. растут сравнительно медленно и не выносят кислых условий. Однако пропионовокислые бактерии могут также сбраживать и молочную кислоту, которая не является подходящим субстратом для большинства других микроорганизмов, осуществляющих брожение. Эту способность и используют для их накопления. С этой целью нейтральную среду, содержащую 20 г лактата натрия и 10 г дрожжевого экстракта на 1 л, засевают каким-нибудь природным материалом, содержащим пропионовокислые бактерии, и инкубируют при 30°С в анаэробных условиях. Наилучшим инокулятом для получения таких культур служит швейцарский сыр, т.к. его созревание обусловлено в основном деятельностью пропионовокислых бактерий.

Сложные накопительные среды можно с успехом использовать для селективного культивирования уксуснокислых бактерий. Эти бактерии хорошо приспособлены к среде с высокими концентрациями спирта. Кроме того, они менее других бактерий чувствительны к уксусной кислоте, которую они образуют из спирта при дыхании. Для их накопления сложную среду, содержащую спирт, инокулируют соответствующим материалом и инкубируют в аэробных условиях. Хорошими источниками инокулята могут быть плоды, цветки и непастеризованное пиво. Можно использовать среду, содержащую 40 мл спирта и 10 г дрожжевого экстракта на 1 л, с рН=6,0. Пиво и крепкий сидр также служат прекрасными накопительными средами, т.к. эти напитки близки к той природной среде, в которой хорошо растут уксуснокислые бактерии. Культура должна иметь большую поверхность контакта с воздухом, но инокулированную среду обычно сильно не аэрируют, т.к. многие уксуснокислые бактерии лучше всего растут в пленке, которую они образуют на поверхности.

98

1. Общие сведения

Физиологию, биохимические свойства, циклы развития микроорганизмов исследуют, как правило, при работе с чистыми культурами. Чистой (аксениче-

ской) культурой микроорганизмов называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Умение выделить микроорганизмы од-

ного вида из смешанной популяции, существующей в природе, и поддерживать чистоту культуры - необходимое условие работы с микроорганизмами. Процесс выделения чистой культуры из смешанной обычно включает предварительный этап получения накопительной культуры (будет рассмотрен отдельно), этап собственно выделения чистой культуры и последующий этап контроля и поддержания чистоты и идентификации микроорганизма.

Всоответствии о биологическими понятиями о виде как основной таксономической единице в микробиологии, вид определяется как эволюционно

сложившаяся совокупность особей, имеющая единый генотип, который в стандартных условиях проявляется сходными морфологическими, физиологическими, биохимическим и другими признаками. Однако генетические ме-

ханизмы, лежащие в основе изменчивости микроорганизмов, обеспечивают только относительную стабильность перечисленных признаков, которые в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (типах) микроорганизмов, отличающихся отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают морфологические (морфовары), биологические (биовары), ферментативные (ферментовары), резистентные к антибиотикам (резистеновары) и бактериофагам (фаговары) варианты бактерий. Наряду с этим, отдельные виды могут включать варианты, различающиеся по антигенной структуре (серовары), экологическим нишам, в которых они обитают(эковары) и патогенности для определенных хозяев (патовары).

Виды, связанные генетическим родством, объединяют в роды, роды - в семейства, семейства - в порядки.

Для названия микроорганизмов используется биноминальная номенклатура, согласно которой первое слово обозначает род. Оно пишется с прописной буквы. Второе слово обозначает вид и пишется со строчной буквы. Обычно назва-

ние рода основано на морфологическом признаке соответствующих микробов

(например, Staphylococcus, Vibrio, Corynebakterium), либо является производным от фамилии автора, который открыл или изучил данный микроорганизм(напри-

мер, Neissеria, Shigella, Escherichia, Ricketsia)..Видовое название часто связано с источником происхождения (например, E.coli - кишечная палочка) или наименованием (проявлением) заболевания (например, S.dusenteriae - дизентерия).

Вмикробиологии широко применяется ряд специальных понятий и терминов. Штамм - более узкое понятие, чем вид. Штаммом называют культуру микробов, выделенную из определенного источника (организма человека, жи-

вотного, окружающей среды). Обычно штаммы обозначают протокольными номерами (или номерами соответствующей коллекции микроорганизмов, либо называют по местности, где он был выделен(например, вирус гриппа Гонконг,

Сингапур), либо по источнику выделения(например, водный, кишечный).

99

Штаммы одного и того же вида могут быть совершенно идентичными или различаются по некоторым признакам, не выходящим за пределы характеристики вида.

Термином КЛОН обозначают культуру микроорганизмов, получен-

ную от одной особи микробной клетки(одноклеточная культура). Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида(штамма или клона), выращенные на питательной среде.

Обычно в практике микробиологических лабораторий для установления принадлежности, выделенной чистой культуры к определенному виду определяют ее основные свойства(признаки): культурально-морфологические (характер роста на жидких и плотных питательных средах), тинкториальные (отношение к красителям), биохимические (ферментация сахаров, спиртов, образование индола, сероводорода и др.) и антигенные.

2. Содержание лабораторного занятия

Цели занятия:

-изучить методы выделения чистых культур микроорганизмов;

-освоить технику выделения чистой культуры по способу Дригальского;

-ознакомится с техникой выделения чистых культур анаэробов;

-освоить методы изучения культурально-морфологических свойств микроорганизмов при росте на плотных и жидких питательных средах.

Материалы и оборудование

Бактериологические петли, чашки Петри с плотной питательной средой, газовые горелки, шпатели. Демонстрационные таблицы, схемы и рисунки, отражающие особенности оценки культурально-морфологических свойств микроорганизмов при их росте на жидких и плотных питательных средах.

Ход работы Методы выделения чистых культур. Для выделения чистых культур

микробов ив материалов, содержащих обильную смешанную микрофлору, предложено много различных методов. Наибольшее распространение получил метод механического разъединения микроорганизмов, находящихся в исследуемом материале, с целью получения изолированных колоний на поверхности или в глубине питательной среды.

Очень часто применяются элективные питательные среды, стимулирующие развитие тех микроорганизмов, чистую культуру которых предполагается выделить.

Индивидуальная устойчивость микробов к тому или иному фактору внешней среды была использована для разработки методов выделения чистых культур путем умерщвления сопутствующей микрофлоры. Этим способом производится выделение споровых форм микробов, устойчивых к действию высоких температур.

При выделении чистой культуры патогенных микробов из патологического материала, загрязненного посторонней микрофлорой, прибегают иногда к за-

100

ражению лабораторных животных, восприимчивых к тому виду микроорганизмов, который предполагается выделить из исследуемого материала.

Получение чистой культуры методом рассева в глубине среды(по Ко-

ху). Три пробирки, содержащие по 15 мл мясо-пептонного агара, ставят в водяную- баню для расплавления агара. Расплавленную среду остужают до температуры 43-45°С. В пробирку вносят бактериологической петлей исследуемый материал и среду перемешивают (встряхивают ударами о ладонь). Для лучшего перемешивания материала со средой засеянную пробирку интенсивно вращают - не сколько раз, зажав между ладонями. После этого прокаленной и остуженной петлей содержимое первой пробирки переносят во вторую, таким же образом - из второй в третью. Приготовленные разведения микробов выливают из пробирок в стерильные чашки Петри, обозначенные номерами, соответствующими номерам пробирок.

После остывания и застудневания (уплотнения) среды с исследуемым материалом в чашках Петри их помещают в термостат. Количество выросших колоний в чашках Петри с питательной средой уменьшается по мере разведения материала.

Выделение чистой культуры по способу Дригальского

При выделении чистой культуры аэробных микробов культуру высевают на поверхность плотной среды. Порядок работы следующий. Расплавленную на кипящей водяной бане стерильную питательную среду, содержащую агар или желатину, разливают в стеклянные чашки Петри. Застывшую среду обязательно подсушивают, т.к. влажная поверхность не способствует образованию сливающегося роста. В первую чашку вносят пипеткой одну каплю исследуемого материала и стерильным шпателем Дригальского втирают ее в поверхность питательной среды сначала на одной половине питательной среды, затем на второй, после чего

этим же шпателем протирают поверхность плотной среды последовательно во второй, третьей и четвертой чашках. Обычно в первых двух чашках после инкубации наблюдают сплошной рост микроорганизмов, тогда как в последующихизолированные колонии (рис.1).

Рис.1 - Рассев культуры микроорганизмов на поверхности плотной среды для выделения чистой культуры по способу Дригальского: 1 - шпатель Дригальского, 2 - рассев, 3 - рост микроорганизмов на трех чашках после последовательного рассева (уменьшение числа колоний в каждой последующей чашке Петри)