Микробиология

61

Прессованные дрожжи нарезают небольшими кусочками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы аутолизат занимал около 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей в 20-литровую бутыль). Бутыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат с температурой 50°С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равномерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец аутолиза характеризуется полным разжижением дрожжей. Аутолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах.

Качество аутолизата ухудшается, если процесс протекает при температуре ниже 58°С. По окончании аутолиза добавляют в бутыль тройное(по исходной массе дрожжей) количество водопроводной воды (на 4 кг дрожжей 16 л воды). Разведенный аутолизат помещают в автоклав для стерилизации при1-1.3 атм (120-123°С) на 30 мин. После автоклавирования аутолизат отстаивают 5-7 суток.

Плотные питательные среды

Питательные свойства плотной среды зависят исключительно от состава питательного бульона, из которого она изготовлена путем добавления агар-агара или желатина. Последние служат как желирующие вещества для создания плотной среды.

К питательному бульону(различным гидролизатам мяса, казеина и др.) добавляют 2-2.5% агар-агара. Емкость с бульоном и агар-агаром помещают на плиту и подогревают до кипения при постоянном помешивании до полного

.растворения агар-агара. Дают готовому (растворенному агар-агару отстояться, после чего фильтруют в горячем состоянии через ватно-марлевый фильтр. Осадок на фильтр не выливают. Агар разливают в горячем состоянии в посуду и стерилизуют 30 минут при 1 атм.

Другим способом изготовления агаровых сред является автоклавирование текучим паром при 100°С в течение 1 ч. Затем агаровую среду оставляют на 1 час для медленного и равномерного отстаивания в теплом месте, проводят коррекцию рН и фильтрацию готового агара.

Фильтрованный агар разливают в посуду, стерилизуют 30 минут при 1 атм. После стерилизации питательный агар, разлитый в пробирки, оставляют, застывать столбиком, если он приготовлен не для немедленного использования, или скашивают (косой агар, "косячки") для непосредственного употребления.

Для скашивания пробирки с горячим агаром укладывают на покатой поверхности или под верхнюю часть пробирок подкладывают резиновую или стеклянную трубку. После остывания на агаровой среде собирается конденсационная жидкость, которая сохраняется лучше, если среду хранить в прохладном месте.

Рост микроорганизмов лучше на влажном агаре, чем на сухом. Последний надо расплавить и дать ему застыть, тогда снова выделится конденсационная вода. Однако проводить многократное кипячение или автоклавирование агара не рекомендуется, т.к. снижается его плотность.

Для разливки в чашки Петри пользуются агаром из колб, флаконов, матрацев или пробирок. Срок годности чашек со средой до48 часов при хранении при комнатной температуре, до 7 суток - при хранении при +4°С. Разлив пита-

62

тельной среды в пробирки осуществляется десятикубичной пипеткой, когда его температура достигнет 70-90°С.

Сухие питательные среды

В последние годы в микробиологии широко пользуются сухими питательными средами. Это избавляет лаборатории от громоздкого процесса приготовления обычных сред, позволяет получать сравнимые результаты в разных лабораториях и, наконец, приближает к разрешению вопроса о стандартности питательных сред. Сухие питательные среды следует хранить герметически закрытыми к по возможности не на свету, т.к. препараты гигроскопичны к светочувствительны. Увлажнение, комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о понижении качества препарата. Сухие препараты, не содержащие глюкозы, даже при комковании могут не терять своих качеств, однако их пригодность следует проверить. При наличии же в сухой среде глюкозы комкование и изменение цвета порошка свидетельствуют о его порче.

Технология приготовления питательных сред из сухих препаратов проста. Навеску, указанную на этикетке, всыпают в стеклянную колбу или бутыль с холодной дистиллированной водой. Затем на водяной бане или текучим паром в автоклаве смесь нагревают до кипения, периодически помешивая. Кипятят до тех пор, пока порошок не растворится (10-20 минут). Выпускают основные, элективные и дифференциальные питательные среды.

Основные среды Сухой питательный агар (рН=7,3-7.б), К растворенному сухому агару (5-

7.5 г сухого агара на 100 мл) рекомендуется добавлять в качестве факторов роста небольшое количество дрожжевого аутолизата, мясной воды, триптического перевара мяса (около 1/3 растворяющей жидкости). Стерилизуют 20 минут при 1 атм.

Сухой питательный агар Д (рН=7.0-7.2) имеет в своем составе: гидролизат кильки, дрожжевой экстракт в качестве фактора роста, прибавления дополнительных ингредиентов не требуется. Способ приготовления прост: 5 г порошка перемешивают в колбе со 100 мл холодной дистиллированной воды, расплавляют путем кипячения 1-2 минуты, фильтруют обычным методом. В готовую среду добавляют (на 100 мл среды) 2 мл глицерина и 1 г глюкозы, разливают во флаконы или матрацы и стерилизуют 30 минут при 110°С или дробным методом.

Кровяные, сывороточные и асцетические среда. К расплавленному и остуженному до 45-50°С питательному агару стерильно добавляют 5-10% дефибринированной крови или такое же количество сыворотки крови, или 251 асцитической жидкости, хорошо перемешивают и сразу же разливают в чашки Петри, пробирки или другую лабораторную посуду. Для приготовления жидкой среды такие же количества сыворотки или асцитической жидкости добавляют к питательному бульону.

Среда с углеводами. К питательному агару или бульону добавляют0.5- 1% углевода. Стерилизацию производят текучим паром или под давлением0.5 атм.

63

Элективные питательные среда Пептонная вода 41%, рН=8.0). Элективна для холерного вибриона. Ще-

лочная реакция среды не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Среда Лефлера. Смесь 1 части лошадиной сыворотки и 3 частей сахарного бульона, скошенная в пробирках. Элективна для выращивания дифтерийных палочек.

Среда (агар) Эндо сухой. 40 г порошка тщательно размешать в колбе с 1000 мл дистиллированной воды, прокипятить 3-5 мин, не допуская пригорания, с закрытой пробкой. Профильтровать через ватно-марлевый фильтр, довести до кипения. Среду остудить до 45-50°С, разлить в стерильные чашки Петри слоем 4- 5 мм, Подсушить в термостате. Среда содержит (на 1 л готового к применению препарата): 17 г - гидродизата кильки, 9.6 г агара, 12.9 г сахара молочного, 0.22 г фуксина основного, 0.48 г натрия фосфорнокислого 2-замещенного, 0.83 г натрия сульфата, 0.01 г натрия углекислого, 3.6 г хлорида натрия, 0.86 г экстракта кор-

мовых дрожжей; рН=7.3 (7.1-7.5).

Среда Левина (среда с эозином и метиленовым синим) выпускается в готовом виде, приготовление аналогично среде Эндо. Если на среде Эндо кишечная палочка при росте образует колонии с металлическим блеском, а сальмонеллы и шигеллы - бесцветные, то на среде Левина E.coli образует синие, или черные колонии, протей растет изолированными оранжевыми колониями, вокруг остальных бактерий среда сохраняет свои цвет.

Среда Плоскирева выпускается промышленностью в готовом виде, приготовление - согласно указанию, имеющемуся на этикетке (аналогично среде Эндо). В состав сухого бактоагара входят: 53.6% сухого питательного агара с желчными солями, 14.4% цитрата натрия, 11% гипосульфита, 12% лактозы, 3.7% фосфата натрия, 0.03-0.06% нейтрального красного, 0.002% бриллиантового зеленого, 1.2% соды кальцинированной, 0.04% йода, 3.7% хлорида натрия. Колонии кишечной палочки окрашиваются на среде Плоскирева в розовый цвет, однако рост этого и других микроорганизмов на сред замедлен. Среда способствует росту микробов тифо-паратифозной группы. Лактозоотрицательные бактерии образуют на этой среде бесцветные колонии, лактозоположительные - красные.

Дифференциально-диагностические среды Среды Гисса. К 1%-ной пептонной воде добавляют0.5% определенного

углевода (глюкоза, мальтоза, лактоза, маннит и др.) и 1% индикатора Андреде (кислый фуксин в раствореNaOH) или 0.1% спиртового (1.5%) бромтимолового синего (можно бромкрезолового пурпурного), нагревают до 80°С и устанавливают рН=7.2. Затем среду кипятят 5 мин, фильтруют, доливают до первоначального объема дистиллированной водой и разливают по пробиркам, в которые помещают поплавок (трубка длиной около 3 см, один конец которой запаян) для улавливания газообразных продуктов, образующихся при разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим паром или паром под давлением0.5 атм, поплавок при этом заполняется питательной средой. Среда при рН=7.2-7.4 бесцветна. При разложении углеводов приобретает красный цвет.

64

Промышленность выпускает сухие среды Гисса (из них готовят полужидкие среды) в виде порошка с углеводами и индикатором ВР(смесь водного голубого и розаловой кислоты). Индикатор ВР при нейтральной реакции среды бесцветен, в кислой среде он имеет синюю окраску, в щелочной - красную. При наличии газа наблюдаются пузырьки его или разрывы в толще агара. Индикатор действует в пределах рН=4.5-8.

Среда Кларка - для определения интенсивности кислотообразования и способности продуцировать ацетилметилкарбинол (реакция Фогеса-Проскауэра). К 80 мл дистиллированной воды добавляют0.5 г пептона, 0.5 г глюкозы, 0.5 г К2НРО4, подогревают при помешивании в течение20 мин. Фильтруют через бумажный фильтр, охлаждают до 20°С и доводят объем до100 мл дистиллированной водой. Разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют 3 дня по 30 мин.

Для определения кислотообразования после 4- суточного роста культуры в этой среде в нее прибавляют3-5 капель 0.04% раствора метилового красного (1 мл 1.6% спиртового раствора метилового красного и39 мл спирта, раствор сохраняется неограниченное время). При сильном кислотообразовании получается красное окрашивание, при слабом - желтое.

Для определения ацетилметилкарбинола ставят реакцию - Фоге Проскауэра. К 4-5 суточной культуре на среде Кларка прибавляют равный объем 10% водного раствора едкого калия и выдерживают при37°С. Через 18-24 часа в результате образования ацетилметилкарбинола на глюкозе среда окрашивается в розовый цвет с желтым оттенком(как эозин), что оценивается как положительный результат.

Среда с рамнозой для сальмонелл(по Биттеру). В 1 л дистиллирован-

ной воды растворяют 0.5 г Na2HPO4, l г (NH4)2SO4, 2 г цитрата натрия, 5 г хлорида натрия, 0.05 г пептона и 5 г рамнозы. Кипятят, фильтруют, стерилизуют текучим паром 2 дня по 30 мин. К суточной культуре прибавляют несколько капель 0.5% спиртового раствора метилового красного. В зависимости от степени кислотности, среда краснеет или остается желтой. S.typhimurium дает красное окрашивание, остальные сальмонеллы - желтое.

Кровяной агар. К расплавленному и охлажденному до45-50°С питательному агару прибавляют5-19% дефибринированной или цельной гепаринизированной (0.05%) крови лабораторного животного (морской свинки, кролика), барана или крупного рогатого скота. Агар с кровью тщательно перемешивают, избегая образования пены, и разливают по чашкам Петри.

Подготовка посуды для культивирования микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов используются бутыли, колбы, флаконы, матрацы, чашки Петри, пробирки.

Основным методом стерилизации лабораторной посуды перед использованием для культивирования микроорганизмов является суховоздушная стерилизация при прогревании воздухом с температурой165-180°С, при более высокой температуре происходит обугливание ватных пробок, бумаги, в которую завернута посуда, а при более низкой температуре снижается эффективность или увеличивается время стерилизации. Лабораторная посуда с готовыми средами перед

65

использованием стерилизуется автоклавированием при давлении 1 атм в течение 20-30 мин, питательные среды с углеводами - при 0.5 атм в течение 15 мин.

Рис.1. - Посуда для культивирования микроорганизмов:

1 – качалочная колба, 2 - качалочная колба с отбойником, 3 - коническая колба, 4 - чашка Петри, 5 - пробирка, 5 – матрац

Разливка жидких стерильных питательных сред и растворов

Для отмеривания и разлива определенных объемов жидких сред, физиологического, буферированного и других растворов пользуются градуированной бюреткой или собирают специальную установку, состоящую из емкости, в которой находится жидкая среда, и соединенную с ней резиновыми трубками через тройник бюреткой. На третье колено тройника надевают резиновую трубку, заканчивающуюся стеклянным наконечником. На резиновые трубки, соединяющие с тройником емкость со средой, и наконечник накладывают зажимы Мора. Ослабляя первый зажим, наполняют градуированный цилиндр (бюретку) жидкостью, затем закрыв первый и открыв(ослабив) второй зажим, выпускают отмеренное количество жидкости в сосуд для питательной среды. Наконечник перед использованием обжигается, а первые порции среды сливаются к не используются для культивирования бактерий.

Разливка плотных стерильных питательных сред в чашки Петри

Плотную питательную среду(агар, желатин) в матрацах, колбах, флаконах, пробирках растапливают в водяной бане или автоклаве текучим паром, сняв предварительно бумажные колпачки. После того, как среда станет жидкой, сосуд (при температуре не выше 70°С) берут в правую руку, левой рукой над огнем вынимают пробку, держат между мизинцем и ладонью, а края матраца, колбы, флакона или пробирки, обжигают.

66

Рис. 2 - Разлив стерильной среды в чашки Петри

Открытую посуду со средой держат в наклонном положении, чтобы избежать попадания в среду микробов из воздуха. В то же время левой рукой приподнимают с одной стороны крышку на чашке Петри и выливают в нее питательную среду в количестве 15-20 мл, слегка покачивая чашку, чтобы среда распределялась равномерным слоем по всей поверхности. Возможно применение автоматов разнообразной конструкции, позволяющих проводить разлив агара в автоматическом режиме.

При застывании агара образуется большое количество конденсационной жидкости, которая оседает на внутренней стороне крышки и увлажняет поверхность среды. Поэтому перед посевом среды подсушивают: чашку в открытом виде помещают в термостат таким образом, чтобы крышка служила опорой для края ее дна, перевернутого средой вниз.

Чтобы избежать образования конденсационной влаги, чашки с расплавленным агаром тотчас после разливки покрывают стерильным листком фильтровальной бумаги, которую стерилизуют вместе с чашкой. Бумага не должна касаться поверхности среды. Когда среда совершенно остынет, фильтровальную бумагу снимают, а чашки закрывают крышками.

67

Лабораторная работа № 2.2.

Основные правила работы с культурами микроорганизмов. Техника посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды

Техника посева микроорганизмов в жидкие, полужидкие и на плотные питательные среды

Для посева могут быть использованы пересеваемые культуры бактерий или исследуемый материал (вода, почва, продукты питания и др.). При пересеве культуры с одной среды на другую или извлечения части культуры для приготовления мазка необходимо соблюдать условия, обеспечивающие предохранение чистой культуры от загрязнения посторонними микроорганизмами. Сохранение чистоты культуры является основой бактериологической работы: только при этом условии возможно выявление всех истинных свойств изучаемого микроорганизма (морфологических, биохимических и др.).

Культуру микроорганизмов извлекают из пробирки с помощью бактериологической петли или иглы, изготовленных из металлической (предпочтительно платиновой или нихромовой) проволоки (рис.3).

Петлю вносят в пробирку с культурой в жидкой, полужидкой или на плотных средах только после тщательной ее стерилизаций в пламени газовой горелки или спиртовки. Для этого проволоку накаливают докрасна в пламени горелки и одновременно обжигают примыкающую к петле часть держателя, которая будет вводиться внутрь сосуда, содержащего микроорганизмы. Петлю рекомендуется держать в пламени горелки почти вертикально, чтобы проволока была равномерна раскалена на всем протяжении. При прокаливании необходимо помнить, что наивысшая температура развивается в верхней и периферической частях пламени (рис. 4), поэтому не следует опускать петлю непосредственно к горелке.

Сразу же после стерилизации петлю(иглу) вводят в сосуд с микроорганизмами. Чтобы не повредить клетки микроорганизмов, петлю вначале охлаждают, прикасаясь ею к внутренней поверхности сосуда или к питательной среде, свободной от клеток микроорганизмов, и только после этого захватывают -не большое количество микробной массы.

Рис.3 - Бактериологические игла (а) и петля (г) для посевов: б, в - петля приготовлена неправильно, г – правильно

68

Отбор культуры микроорганизмов, выращенных на плотной среде в пробирке, осуществляют следующим образом (рис.4). Пробирку с культурой берут в левую руку так, чтобы поверхность питательной среды с налетом выросших микроорганизмов была обращена к верху и хорошо видна. Пробирку держат в горизонтальном или несколько наклонном положении.

Рис.4 - Способ стерильного извлечения культуры микроорганизмов бактериологической петлей из пробирки

В правую руку берут петлю так, как держат карандаш, и прокаливают ее в пламени горелки. Затем, не выпуская петли, мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижимают ватную пробку к ладони, вынимают ее пробирки и держат так во время последующих манипуляций. Края открытой пробирки с культурой микроорганизмов обжигают в пламени горелки и после этого вводят в пробирку стерильную петлю.

Взяв небольшое количество микробной массы с поверхности субстрата, вынимают петлю из пробирки, следя за тем, чтобы переносимый материал не ка-

69

сался стенок или краев пробирки. Горлышко пробирки снова обжигают в пламени горелки, затем обжигают ватную пробку и закрывают ею пробирку. Если конец ватной пробки загорится, то не следует бросать пробку. Ее нужно ввести быстро в пробирку, где вата сама потухнет. Ни в коем случае нельзя дуть на загоревшуюся пробку, т.к. это только усилит горение. Если в момент пересева ватная пробка упадет на стол или на пол, то не следует снова вставлять ее в пробирку. Нужно либо хорошо обжечь ее, либо (что предпочтительнее) взять новую стерильную пробку и начать всю операцию заново. Закрытую ватной пробкой пробирку с культурой ставят в штатив, а извлеченный материал используют для пересева или приготовления мазка.

Пересев чистых бактериальных культур является наиболее частой манипуляцией в повседневной лабораторной практике. Пересев чистой культуры на свежую питательную среду необходим для сохранения жизнедеятельности микробов, т.к. при росте они извлекают из среды питательный материал и насыщают ее продуктами собственного обмена, вследствие чего среда становится непригодной для нормального роста микробов. При исследовании морфологических и биологических свойств микробов тоже необходимы посевы на свежие среды, т.к. их изучение проводится у культур определенного возраста. Для установления микробиологического диагноза и разрешения ряда практических задач(например, приготовление вакцин, культур-продуцентов, используемых в биотехнологии и др.) пользуются посевами чистых культур микробов.

Основным и непременным условием посева является сохранение чистоты культуры, т.е. постоянное сохранение в пробирке только одного вида микробов, без загрязнения его посторонними микроорганизмами. Для этого необходимо соблюдение всех деталей техники посева, обеспечивающих стерильность. Следует помнить, что, несмотря на быстроту всех манипуляций, открытые пробирки некоторое время соприкасаются с воздухом, всегда содержащим большое количество микробов. Чтобы не внести их в пробирки, все движения руки при посеве должны быть быстрыми, но точными и осторожными. Пробирки следует держать только наклоненными, т.к. в прямом положении в них в большей степени как бы "падают" вместе с пылью бактерии и грибки из воздуха. При посеве без защиты органов дыхания (ватно-марлевые повязки, респираторы, "лепестки" и др.) нельзя разговаривать, кашлять; в комнате не должно быть значительных колебаний воздуха. Недопустимо подметание пола во время или незадолго до посева.

Посевы (пересевы) на плотные среды

Самым частым методом пересева бактерий является посев в пробирку с косым агаром. Он включает следующие этапы.

1. Пробирку с чистой культурой на косом агаре берут в левую руку в наклонном горизонтальном положении между большим пальцем и первой пястной костью. Скошенная поверхность агара повернута к глазам и должна быть вся видна. Сверху (рядом) с пробиркой с культурой помещают точно в таком же положении пробирку с незасеянной питательной средой. Пробирки держат в таком положении, не выпуская их и не переставляя во время всей манипуляции пересе-

ва (рис.5.).

70

2.Взяв в правую руку петледержатель, как писчее перо, стерилизуют петлю в пламени горелки.

3.Мизинцем правой руки плотно захватывают наружные концы ватных пробок, прижав их к ладонной поверхности руки, и вынимают пробки из пробирок. При дальнейших манипуляциях следят, чтобы пробки ни к чему не прикасались.

4.Обжигают края пробирки на пламени горелки.

5.Вводят петлю в пробирку с культурой. Прикоснувшись петлей к участку среды, свободному от "микробного газона", убеждаются, что петля остыла (агар не должен "кипеть" под петлей), берут полную петлю культуры.

6.Быстро переносят петлю с взятым материалам в пробирку с питательной средой, не задевая краев и стенок обеих пробирок.

7.Опуская петлю до конденсационной воды, находящейся у дна пробирки, делают посев культуры на окошенной поверхности среды одним из трех способов: а) посев чертой - проводят петлю по прямой линии по середине питательной среды от конденсационной воды до верхнего края; б) посев "штрихом" - проводят зигзагообразную линию, скользя петлей по поверхности среды от одного края пробирки к другому, поднимая штрихи от конденсационной воды до верхушки среды; в) посев сплошным газоном - растирают материал непрерывными круговыми движениями по всей поверхности питательной среды.

8.Вынимают петлю из пробирки. Быстро обжигают края пробирки, внутренние концы пробок и закрывают пробирки.

Рис 5 - Пересев ив одной пробирки в другую